Denne undersøgelse beskriver en invasiv procedure for induktion af accelereret åreforkalkning hos mus. I forhold til andre metoder, der anvender elektrisk- eller kryo-induceret skade, mekanisk-induceret skade efterligner den menneskelige tilstand af restenosis efter revaskularisering behandlinger og er ideel til undersøgelse af de molekylære involverede mekanismer.
Åreforkalkning er en proliferativ fibro-inflammatorisk sygdom udvikler sig i arterievæggen, inducerer en mangelfuld blodgennemstrømning eller en mangel på blodgennemstrømning. Desuden, ved brud på den defekte vaskulære væg, åreforkalkning inducerer okklusiv trombe dannelse, som repræsenterer den vigtigste årsag til myokardieinfarkt eller slagtilfælde og den hyppigste dødsårsag. På trods af fremskridtene på det kardiovaskulære område er mange spørgsmål stadig ubesvarede, og yderligere grundforskning er afgørende for at forbedre vores forståelse af de molekylære mekanismer under åreforkalkning og dens virkninger. På grund af begrænsede kliniske undersøgelser er der behov for repræsentative dyremodeller, der genskaber aterosklerotiske tilstande såsom neointimadannelse efter stentimplantatation, ballonensgioplastik eller endarterektomi. Da musen præsenterer mange fordele og er den hyppigst anvendte model for at studere molekylære processer, den nuværende undersøgelse foreslår en invasiv procedure for endotel denudalisering, også kendt som wire-skade model, som er repræsentativ for den menneskelige tilstand neointima dannelse i arterierne efter revaskularisering procedurer.
Åreforkalkning er den vigtigste patologi underliggende kardiovaskulære hændelser såsom myokardieinfarkt eller slagtilfælde. De vigtigste mekanismer, der udløser akutte hjerte-kar-syndromer er plaque brud, overfladisk erosion, og trombe dannelse. Der er flere kliniske situationer forbundet med plaque udvikling: indfødte aterosklerotisk plaque, restenosis efter endarterektomi, og restenosis efter ballon ballonudvidelse med / uden stent implantation1. Efter arteriel skade, undertrykkelse af de inflammatoriskeprocesser 2,3 og inddrivelse af endotelrummet er afgørende for at forhindre yderligere komplikationer1. Klinisk forskning er begrænset til væv og blodprøver på grund af etiske overvejelser, omkostninger, og manglende viden i grundlæggende mekanismer. Af disse grunde er der behov for at studere molekylære mekanismer i dyremodeller4-6, som kan genskabe de kliniske forhold. Vores model for accelereret neointima dannelse i forbindelse med åreforkalkning er resultatet af mange års erfaring i gennemførelsen af disse modeller i små dyr7-11. Musemodellen er den mest attraktive model for forskning, på grund af sin nemme håndtering, evnen til at have store dyregrupper på grund af lave omkostninger i forbindelse med køb og pleje af dyr, og tilgængeligheden af forskellige transgene og knockout stammer.
Den største ulempe ved musemodellen er den lille størrelse af de vigtigste arterier udsat for aterosklerotisk sygdom (halspulsåren, aorta, og lårpulsåren), som kræver kvalificeret kirurgisk ekspertise og færdigheder til at manipulere fartøjer og invasivt fremkalde en aterosklerotisk plaque. Derfor er modellen med accelereret neointima dannelse, i forbindelse med restenosis efter endarterektomi eller stent implantation, foreslået i dette papir præsenteres med en trin-for-trin retningslinje og forslag til at lette indførelsen for interesserede personale. En anden ulempe er, at denudationen foretages på den normale arteriel væg, og derfor vil neo-intima formationen være moderat sammenlignet med den kliniske situation. Det høje niveau af plasma kolesterol nået i apolipoprotein E knockout (Apoe-/-) mus fodret med et højt fedtindhold-kost skaber en ordentlig pro-inflammatorisk miljø er nødvendige for neo-intima dannelse.
Operationen udføres under et stereomikroskop. Halspulsåren eksponeres ved et midterindsnit i det ventrale livmoderhalshalsbunds område. Anatomiske strukturer på toppen af og omkring halspulsåren er minimalt manipuleret til at reducere post-kirurgisk inflammation. Halspulsåren bifurcation er udsat. At fremkalde accelereret neointima dannelse, interne og eksterne halspulsårer er forberedt til blodgennemstrømning ophør og efterfølgende fælles halspulsåren denudation. Afslutningsvis kan metoden læres af personale med minimal erfaring i dyreoperationer.
I dette papir giver vi nyttige tips til at udføre wire-skade procedure selv af personale med minimal erfaring i dyreoperationer. Der er to kritiske trin i udførelsen af denne procedure: indsnit af den eksterne halspulsåren og indsættelsen af ledningen. Snittet i den eksterne halspulsåre skal udføres så meget som muligt fra bifurcationen for at sikre tilstrækkeligt resterende materiale (Figur 1C). Snittet bør ikke være for stort på grund af risikoen for at skære hele fartøjet. Det andet kritiske trin er den høje risiko for blødning under arterien og indsættelsen af guidewiren, hvis blodgennemstrømningen ikke afbrydes effektivt. Desuden kan endotelbelægning ikke finde sted, eller arteriel brud er muligt, hvis guidewiren ikke er korrekt indført i lumen fartøjet. For at undgå dette skal styreledningens overflade være omhyggeligt poleret, før betjeningen.
For at optimere protokollen sikrer placeringen af operationsbordet med musehovedet mod kirurgen et bedre overblik, tilgængelighed og kontrol for korrekt styretrådmanipulation. For at øge reproducerbarheden skal du desuden bruge den samme styretråd i alle undersøgelserne. Da trådstørrelsen ikke ændres, er det vigtigt at overveje og eliminere alle de mulige forskelle mellem musene ved at bruge samme køn, alder og vægt for alle mus, der indgår i en undersøgelse. Derefter vil Evans-Blue farvning hjælpe kirurgen bestemme effektiviteten af denudationen. Eksistensen af passende udstyr er en forudsætning for, at proceduren kan lykkes. Et 10X stereomikroskop er afgørende for at udføre denne procedure. Korrekt forberedelse af guide-wire (for eksempel polering det) er afgørende. Derfor anbefaler vi på det kraftigste, at guidetråden klargøres af specialiseret teknisk personale, hvor det er muligt.
Der er mange fejlfindingstrin i denne protokol. Hvis du instænerer den eksterne halspulsåre nær bifurcationen, bindes den omhyggeligt externa i nærheden af bifurcationen, så der ikke opstår blødning. Under skæringen kan den eksterne halspulsåre ikke ses. Derfor overveje bifurcation på niveau med silke sutur. Opsaml sektioner, når silkesuturen forsvinder. Hvis snittet i den eksterne halspulsåren er for stort, og fartøjet er bristet, skal du sikre dig, at blodgennemstrømningen til halsgangen og den interne halspulsåre afbrydes effektivt, og forsøge at finde åbningen af fartøjet ved hjælp af scener. Efter indførelse af guidewiren og udførelse af denudationen bindes fartøjet nær bifurcationen. Under skæringen skal du begynde at samle sig, når silke fra suturen begynder at forsvinde. Hvis der opstår brud på arteriel under denudationen med styretråden, skal du kontrollere under mikroskopet, om styreledningen er korrekt poleret.
På trods af ligheden mellem wire-skade model til kliniske situationer, mange grupper er fokuseret på indfødte åreforkalkning i mus, eller de vælger invasive åreforkalkning induktion, såsom ballon angioplastik hos rotter eller kaniner, på grund af manglen på uddannet personale, der kan udføre små dyreoperationer. På trods af fordelene ved at bruge kaniner/rotter, fx ikke behov for miniaturiseret udstyr, tilbyder hverken rottemodeller eller kaninmodeller en række forskellige knock-out-stammer med hensyn til at studere molekylære mekanismer, der er involveret i neointimavækst og in-stenttrombose.
De eksisterende modeller for at studere in-stentose resten mus er vanskelige, kræver høje kirurgiske færdigheder, og har stor risiko for komplikationer såsom blødning eller lammelse. For eksempel ledsages den mekaniske skade eller stentimplantatation i thorax aorta via lårpulsåren af en høj dødelighed (35 %) på grund af bagbenslammelse ellerblødning 13-15. Vi beskriver også stentimplantatisering i halspulsåren på en mus16. Proceduren er den samme; vævsbehandling til analyse er imidlertid kompliceret og er ikke tilgængelig for alle laboratorier16. Halspulsåren er direkte tilgængelig, ikke kun for driftsprocedurer, men også for eksisterende billeddannelsesmetoder såsom ultralydsscanning. Andre skade induktioner i halspulsårerne i mus kan gøres ved hjælp af elektriske enheder17. Denne metode er nem at udføre og sikrer høj reproducerbarhed. Den medfører imidlertid skade i alle karlag, som ikke er identiske med mekanisk skade. Ballonapplikationer har fordele, f.eks. Selv om musen balloner er tilgængelige, de er meget dyre og derfor ikke udbredt. I stedet wire-skade er den etablerede metode, efterligne in-stent stenose.
Denudationen udføres på den normale arteriel væg, men med en aterosklerotisk baggrund. Derfor vil neointimadannelsen være moderat sammenlignet med den kliniske situation. Det høje antal prækliniske modeller viser, at ingen af modellerne opfylder alle de kriterier, der er nødvendige for at afdække hele de cellulære og molekylære mekanismer, der fører til patofysiologi hos mennesker (se tabel 2).
Efter udførelse af wire-skade procedure, kan andre biologiske og molekylære analyse udføres for at identificere celler, proteiner, mRNAs, microRNAs, gener eller andre biomarkører, som kan bruges som terapeutiske mål til at udvikle nye behandlingsstrategier for åreforkalkning, og især for neointima dannelse efter vaskulær skade. Hvis det er muligt, kan plaque vækst overvåges ved hjælp af højfrekvent ultralyd eller andre høj opløsning billeddannelse teknikker. Desuden ville beherske denne teknik give operatøren mulighed for at tilpasse protokollen til andre invasive åreforkalkningsanledningsmodeller, såsom kraveplacering, delvis ligation eller endda stentimplantatation.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Interdisciplinary Centre for Clinical Research IZKF Aachen (junior forskningsgruppe til E.A.L.) inden for det medicinske fakultet på RWTH Aachen University. Vi takker også Fru Roya Soltan for hjælp med immunhisekemi farvning.
Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
section thickness 100 µm, | |||
polytetrafluorethylene catheter | |||
PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |