Denne studien beskriver en invasiv prosedyre for induksjon av akselerert aterosklerose hos mus. Sammenlignet med andre metoder ved hjelp av elektrisk- eller kryo-indusert skade, etterligner mekanisk-indusert skade den menneskelige tilstanden til restenose etter revaskulariseringsbehandling og er ideell for studiet av de molekylære mekanismene som er involvert.
Aterosklerose er en proliferativ fibro-inflammatorisk sykdom som utvikler seg i arteriell vegg, induserer en mangelfull blodstrøm eller mangel på blodstrøm. Videre, ved brudd på den defekte vaskulære veggen, induserer aterosklerose okklusiv trombedannelse, som representerer hovedårsaken til hjerteinfarkt eller hjerneslag og den hyppigste dødsårsaken. Til tross for fremskrittene i kardiovaskulærfeltet, forblir mange spørsmål ubesvart, og ytterligere grunnleggende forskning er avgjørende for å forbedre vår forståelse av molekylære mekanismer under aterosklerose og dens effekter. På grunn av begrensede kliniske studier er det behov for representative dyremodeller som gjenskaper aterosklerotiske tilstander som neointimadannelse etter stentimplantasjon, ballongangoplastikk eller endarterektomi. Siden musen presenterer mange fordeler og er den mest brukte modellen for å studere molekylære prosesser, foreslår den nåværende studien en invasiv prosedyre for endoteldeudasjon, også kjent som wire-skademodellen, som er representativ for den menneskelige tilstanden til neointimadannelse i arterier etter revaskulariseringsprosedyrer.
Aterosklerose er den viktigste patologien underliggende kardiovaskulære hendelser som hjerteinfarkt eller hjerneslag. De viktigste mekanismene som utløser akutte kardiovaskulære syndromer er plakkbrudd, overfladisk erosjon og trombedannelse. Det er flere kliniske situasjoner knyttet til plakkutviklingen: innfødt aterosklerotisk plakk, restenose etter endarterektomi og restenose etter ballong angioplastikk med / uten stentimplantasjon1. Etter arteriell skade er undertrykkelse av de inflammatoriske prosessene2,3 og gjenopprettingen av endeotelrommet avgjørende for å forhindre ytterligere komplikasjoner1. Klinisk forskning er begrenset til vev og blodprøver på grunn av etiske hensyn, kostnader, og mangel på kunnskap i grunnleggende mekanismer. Av disse grunnene er det behov for å studere molekylære mekanismer i dyremodeller4-6, som kan gjenskape de kliniske forholdene. Vår modell av akselerert neointima dannelse i sammenheng med aterosklerose er et resultat av mange års erfaring i gjennomføringen av disse modellene i små dyr7-11. Musemodellen er den mest attraktive modellen for forskning, på grunn av sin enkle håndtering, evnen til å ha store dyregrupper på grunn av lave kostnader knyttet til dyrekjøp og omsorg, og tilgjengeligheten av ulike transgene og knockout stammer.
Den største ulempen med musemodellen er den lille størrelsen på hovedarteriene utsatt for aterosklerotisk sykdom (halspulsåren, aorta og lårarterien), som krever kvalifisert kirurgisk ekspertise og ferdigheter for å manipulere karene og å invasivt indusere en aterosklerotisk plakk. Derfor presenteres modellen av akselerert neointimadannelse, i sammenheng med restenose etter endarterektomi eller stentimplantasjon, foreslått i dette papiret med en trinnvis retningslinje og forslag for å lette innføringen for interessert personell. En annen ulempe er at denudasjonen er gjort på den normale arterielle veggen, og derfor vil neo-intimaformasjonen være moderat sammenlignet med den kliniske situasjonen. Det høye nivået av plasmakolesterol nådd i apolipoprotein E knockout (Apoe-/-) mus matet med høyt fett-diett skaper et riktig pro-inflammatorisk miljø som trengs for neo-intima formasjon.
Operasjonen utføres under et stereomikroskop. Halspulsåren er utsatt for et median snitt i ventralhalsområdet. Anatomiske strukturer på toppen av og rundt halspulsåren er minimalt manipulert for å redusere postkirurgisk betennelse. Halspulsåren bifurcation er utsatt. For å indusere akselerert neointimadannelse, er interne og eksterne halspulsårarterier forberedt for blodstrømsslutt og påfølgende vanlig halspulsårendeudasjon. Til slutt kan metoden læres av personell med minimal erfaring i dyreoperasjoner.
I dette papiret gir vi nyttige tips for å utføre ledningsskadeprosedyren selv av personell med minimal erfaring i dyreoperasjoner. Det er to kritiske skritt i å utføre denne prosedyren: snittet av den eksterne halspulsåren og innsetting av ledningen. Snittet i den ytre halspulsåren må utføres så langt som mulig fra bifurcation, for å sikre nok gjenværende materiale (Figur 1C). Snittet bør ikke være for stort, på grunn av risikoen for å kutte hele fartøyet. Det andre kritiske trinnet er den høye risikoen for blødning under arteriotomien og innsetting av ledevaieren hvis blodstrømmen ikke er effektivt seponert. Videre kan endoteldeudasjon ikke finne sted eller arteriell brudd er mulig hvis føringsledningen ikke er riktig introdusert i lumenbeholderen. For å unngå dette må overflaten på føringsledningen polerings forsiktig før operasjonen.
For å optimalisere protokollen sikrer plasseringen av operasjonsbordet med musehodet mot kirurgen en bedre visning, tilgjengelighet og kontroll for riktig ledevaiermanipulasjon. Videre, for å øke reproduserbarheten, bruk samme ledevaier i alle studiene. Siden trådstørrelsen ikke endres, er det viktig å vurdere og eliminere alle mulige forskjeller mellom musene ved å bruke samme kjønn, alder og vekt for alle mus som er inkludert i en studie. Deretter vil Evans-Blue farging hjelpe kirurgen med å bestemme effektiviteten av denudasjonen. Eksistensen av passende utstyr er en forutsetning for prosedyrens suksess. Et 10X stereomikroskop er avgjørende for å utføre denne prosedyren. Riktig fremstilling av ledevaieren (for eksempel polering av den) er avgjørende. Derfor anbefaler vi på det sterkeste at føringsledningspreparatet utføres av spesialisert teknisk personell der det er tilgjengelig.
Det er mange feilsøkingstrinn i denne protokollen. Hvis du incising den ytre halspulsåren nær bifurcation, forsiktig binde externa, nær bifurcation, slik at ingen blødning oppstår. Under skjæring kan ikke den eksterne halspulsåren ses. Derfor bør du vurdere bifurcation på nivået av silkesutur. Samle seksjoner når silkesuturen forsvinner. Hvis snittet i den ytre halspulsåren er for stor og fartøyet er sprukket, sørg for at blodstrømmen inn i halsmunningen og den indre halspulsåren effektivt avbrytes og prøver å finne åpningen av fartøyet ved hjelp av tang. Etter innføring av ledevaieren og utført denudasjonen, bind fartøyet nær bifurcation. Under skjæring begynner du å samle når silke fra suturen begynner å forsvinne. Hvis arteriell brudd oppstår under denudasjonen med ledevaieren, må du kontrollere under mikroskopet om ledevaieren er riktig polert.
Til tross for likheten mellom trådskademodellen til kliniske situasjoner, er mange grupper fokusert på innfødt aterosklerose hos mus, eller de velger invasive aterosklerose induksjoner, for eksempel ballongangoplastikk hos rotter eller kaniner, på grunn av mangel på trent personell som kan utføre små dyreoperasjoner. Til tross for fordelene ved å bruke kaniner/rotter, for eksempel ikke behov for miniatyrisert utstyr, tilbyr verken rottemodeller eller kaninmodeller en rekke forskjellige utslagsstammer, når det gjelder å studere molekylære mekanismer involvert i neointimavekst og trombose i stent.
De eksisterende modellene for å studere in-stentose hos mus er vanskelige, krever høye kirurgiske ferdigheter, og har høy risiko for komplikasjoner som blødning eller lammelse. For eksempel er den mekaniske skaden eller stentimplantasjonen i thorax aorta via lårarterien ledsaget av høy dødelighet (35%) på grunn av lammelse av bakbenet ellerblødning 13-15. Vi beskriver også stentimplantasjon i halspulsåren til en mus16. Prosedyren er lik; Vevsbehandlingen for analyse er imidlertid komplisert og er ikke tilgjengelig for alle laboratorier16. Halspulsåren er direkte tilgjengelig, ikke bare for operasjonsprosedyrer, men også for eksisterende bildemetoder som ultralydavbildning. Andre skadeinduksjoner i halspulsårene hos mus kan gjøres ved hjelp av elektriske apparater17. Denne metoden er enkel å utføre og sikrer høy reproduserbarhet. Det induserer imidlertid skade i alle karlag, som ikke er identisk med mekanisk skade. Ballongapplikasjoner har fordeler, for eksempel justeringen av fartøyets diameter i tråd med klinisk praksis og har sterk innflytelse på det patologiske utfallet. Selv om museballonger er tilgjengelige, er de svært dyre og derfor ikke mye brukt. I stedet er wire-skaden den etablerte metoden, etterligner in-stent stenose.
Denudasjonen utføres på den normale arterielle veggen, men med en aterosklerotisk bakgrunn. Derfor vil neointimaformasjonen være moderat sammenlignet med den kliniske situasjonen. Det høye antallet prekliniske modeller viser at ingen av modellene oppfyller alle kriteriene som er nødvendige for å avdekke helheten av cellulære og molekylære mekanismer som fører til patofysiologi hos mennesker (se tabell 2).
Etter å ha utført ledningsskadeprosedyren, kan andre biologiske og molekylære analyser utføres for å identifisere celler, proteiner, mRNAer, microRNAer, gener eller andre biomarkører, som kan brukes som terapeutiske mål for å utvikle nye behandlingsstrategier for aterosklerose, og spesielt for neointimadannelse etter vaskulær skade. Hvis tilgjengelig, kan plakkveksten overvåkes ved hjelp av høyfrekvent ultralyd eller andre høyoppløselige bildeteknikker. Videre ville mestring av denne teknikken gi operatøren muligheten til å tilpasse protokollen til andre invasive ateroskleroseinduksjonsmodeller, for eksempel krageplassering, delvis ligation eller til og med stentimplantasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Tverrfaglig senter for klinisk forskning IZKF Aachen (junior forskningsgruppe til E.A.L.) ved det medisinske fakultet ved RWTH Aachen University. Vi takker også Mrs. Roya Soltan for hjelp med immunohistochemistry farging.
Stereomicroscope | Olympus | SZ/X9 | – |
Forceps | FST, Germany | 91197-00 | standard tip curved 0,17 mm |
Hemostat forceps | FST, Germany | 13007-12 | curved |
Scissors | FST, Germany | 91460-11 | Straight |
Vannas scissor | Aesculap, Germany | OC 498 R | – |
Retractors | FST, Germany | 18200-10 | 2.5mm wide |
Retractors | FST, Germany | 18200-11 | 5mm wide |
Ketamine 10% | CEVA, Germany | – | – |
Xylazine 2% | Medistar, Germany | – | – |
Bepanthene eye and nose cream | Bayer, Germany | – | – |
Silicon tube | IFK Isofluor, Germany | custom-made product | diameter 500µm, |
section thickness 100 µm, | |||
polytetrafluorethylene catheter | |||
PROLENE Suture 6/0 | ETHICON | 8707H | polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13mm, 3/8 Circle |
7/0 Silk | Seraflex | IC 1005171Z | – |
Michel Suture Clips | FST, Germany | 12040-01 | - |
Clip Applying Forcep | FST, Germany | 12018-12 | - |
14”Wire for Catheter | Abbot | 1000462H | Use 10 cm from stiff part and equalize the ends |
Mice | Charles River | Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background | - |