Here, sporulation of Saccharomyces cerevisiae is carried out in a 96 multiwell format.
During times of nutritional stress, Saccharomyces cerevisiae undergoes gametogenesis, known as sporulation. Diploid yeast cells that are starved for nitrogen and carbon will initiate the sporulation process. The process of sporulation includes meiosis followed by spore formation, where the haploid nuclei are packaged into environmentally resistant spores. We have developed methods for the efficient sporulation of budding yeast in 96 multiwell plates, to increase the throughput of screening yeast cells for sporulation phenotypes. These methods are compatible with screening with yeast containing plasmids requiring nutritional selection, when appropriate minimal media is used, or with screening yeast with genomic alterations, when a rich presporulation regimen is used. We find that for this method, aeration during sporulation is critical for spore formation, and have devised techniques to ensure sufficient aeration that are compatible with the 96 multiwell plate format. Although these methods do not achieve the typical ~80% level of sporulation that can be achieved in large-volume flask based experiments, these methods will reliably achieve about 50-60% level of sporulation in small-volume multiwell plates.
وقد درس تبوغ في الخميرة في مهدها لتقديم رؤى في جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك السيطرة على الفصل كروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي 1، آليات إعادة التركيب الجيني 2، والسيطرة على التنمية من خلال خلية يشير 3، ومراقبة التغذية التنمية 4، والنسخي تنظيم التنمية 5، والنظر في تشكيل بوغ 6. يتضمن تشكيل بوغ حدث انقسام الخلايا رواية تنطوي على تشكيل المقصورات غشاء جديدة داخل الخلية الأم تليها ترسب جدار بوغ واقية 6. هذه الدراسات أن دراسة الخلايا sporulating في كثير من الأحيان الاستفادة من sporulating بسرعة الخميرة سلالة SK1، والتي يمكن أن تخضع لعملية تكاثر في حوالي 24 ساعة بطريقة فعالة نسبيا 7،8. وعلى الرغم من وصفت تحسين ظروف تبوغ لفي مهدها الخميرة 13/9، هذه التجربةالصورة فحص تبوغ على وسائل الاعلام الصلبة أو في جو من الثقافات السائل على نطاق وحين ينفذ تبوغ من استخدام أنابيب ثقافة أو قوارير.
نحن هنا تصف طريقة لsporulating الخميرة في شكل لوحة multiwell 96. نجد أن لهذا الأسلوب، تهوية أمر بالغ الأهمية للتبوغ متزامن وكفاءة، وقد ابتكرت تقنيات لضمان تبوغ كافية لصغيرة الحجم شكل multiwell. Sporulating في شكل 96 لوحة multiwell يسمح للخلايا ليتم عرضه باستخدام تقنيات عالية الإنتاجية والكواشف الأمثل لشكل لوحة multiwell، مثل هذا الفحص لالمكثفات نسخة عالية باستخدام مكتبة مزينة بالبلاط 14-16.
هنا نقدم بروتوكول للsporulating SK1 الخميرة في شكل multiwell 96. التهوية هي المفتاح للتبوغ كفاءة، الأمر الذي يتطلب استخدام إما بقضيب أو حبة الزجاج في كل بئر. عندما يتم sporulated الخلايا في لوحة multiwell 96 في حاضنة تهتز دون أي حبة أو بقضيب، الخلايا لا sporulate بكفاءة. وينظر فقط زيادة صغيرة في ?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من خلال منحة جوزيف هيلي من جامعة ماساتشوستس في بوسطن (LSH) وR15 GM86805 من المعاهد الوطنية للصحة (LSH). ويدعم SMP جزئيا على زمالة سانوفي-جنزايم في جامعة ماساتشوستس في بوسطن.
Nunc 1.3 ml DeepWell Plates | ThermoScientific | 260251 | Used for sporulation |
Nunc 2.0 ml DeepWell plates | ThermoScientific | 278743 | Used for presporulation growth, step 1.2.3 |
3 mm glass bead | Fisher | 11-312A | Used for sporulation |
5 mm x 2 mm stir bar, pack of 12 | Fisher | 14-511-82 | Used for sporulation |
96 well frogger | V&P Scientific | VP407 | needed for step 1.2 |
library copier | V&P Scientific | VP381 | needed for step 1.2; to be used with the frogger |
rectangular petri dish | ThermoScientific | 264728 | needed for step 1.2 |
Bacto Peptone | BD | 211677 | needed for media |
Yeast Extract | BD | 212750 | needed for media |
Bacto Agar | BD | 212750 | needed for media |
Dextrose | Fisher | D16-3 | needed for media |
Potassium Acetate | Fisher | P171-500 | needed for media |
Glycerol | Fisher | G33-500 | needed for media |
Black 96 well glass bottom plate | MatTek | PBK96G-1.5.5-F | needed for step 2.4 |