تبوغ الفعال لل<em&gt; خميرة الخباز</em&gt; في تنسيق Multiwell 96

ملخص

هنا ، يتم إجراء إبواغ خميرة الخميرة بتنسيق 96 متعدد الآبار.

الملخص

خلال أوقات الإجهاد الغذائي ، تخضع خميرة الخميرة للكونين الأمشاجي ، والمعروف باسم الأبواغ. ستبدأ خلايا الخميرة ثنائية الصبغيات التي يتم تجويعاها للنيتروجين والكربون عملية التبواغ. تتضمن عملية التبوغ الانقسام الاختزالي متبوعا بتكوين الأبواغ ، حيث يتم تعبئة النوى أحادية الصيغة الصبغية في جراثيم مقاومة للبيئة. لقد طورنا طرقا للتبواغ الفعالة للخميرة الناشئة في 96 لوحة متعددة الآبار ، لزيادة إنتاجية خلايا الخميرة الغربلة للأنماط الظاهرية للأبواغ. تتوافق هذه الطرق مع الفحص باستخدام الخميرة المحتوية على البلازميدات التي تتطلب الاختيار الغذائي ، عند استخدام الحد الأدنى من الوسائط المناسبة ، أو مع فحص الخميرة مع التعديلات الجينومية ، عند استخدام نظام غني بالإسبوغ. وجدنا أنه بالنسبة لهذه الطريقة ، يعد التهوية أثناء التبوغ أمرا بالغ الأهمية لتكوين الأبواغ ، وقد ابتكرنا تقنيات لضمان تهوية كافية متوافقة مع تنسيق الألواح متعددة الآبار 96. على الرغم من أن هذه الطرق لا تحقق المستوى النموذجي ~ 80٪ من التبواغ الذي يمكن تحقيقه في التجارب القائمة على القارورة ذات الحجم الكبير ، إلا أن هذه الطرق ستحقق بشكل موثوق حوالي 50-60٪ من التبوغ في الألواح متعددة الآبار صغيرة الحجم.

المقدمة

وقد درس تبوغ في الخميرة في مهدها لتقديم رؤى في جوانب كثيرة من الأحياء، بما في ذلك السيطرة على الفصل كروموسوم أثناء الانقسام الاختزالي ^1، آليات إعادة التركيب الجيني ^2، والسيطرة على التنمية من خلال خلية يشير ^3، ومراقبة التغذية التنمية ^4، والنسخي تنظيم التنمية ^5، والنظر في تشكيل بوغ ^6. يتضمن تشكيل بوغ حدث انقسام الخلايا رواية تنطوي على تشكيل المقصورات غشاء جديدة داخل الخلية الأم تليها ترسب جدار بوغ واقية ^6. هذه الدراسات أن دراسة الخلايا sporulating في كثير من الأحيان الاستفادة من sporulating بسرعة الخميرة سلالة SK1، والتي يمكن أن تخضع لعملية تكاثر في حوال....

البروتوكول

1. الاستعداد للتبوغ

ملاحظة: وسائل الإعلام وصفها في هذا البروتوكول تتم باستخدام وصفات وطرق معيارية ^13،17 يعطي الجدول 1 صياغة ل1 لتر من وسائل الإعلام المختلفة المستخدمة في هذا البروتوكول.

Bacto ببتون

خلاصة الخميرة

النتائج

لتقييم هذا البروتوكول، وتمت مقارنة الكفاءة تبوغ تم الحصول عليها من sporulating الخلايا في لوحات multiwell (كما هو موضح أعلاه) إلى خلايا sporulated استخدام كميات أكبر في قوارير (الجدول 2). وقال إن استخدام لوحات multiwell لا يحقق كفاءة عالية ينظر عندما sporulating في قوارير، حيث كفاءة ~ 80٪ يمكن أن ينظر إليه بشكل روتيني. يمكن Sporulating في لوحات multiwell مع التهوية المناسبة (التي تقدمها الخرز الزجاجي أو أشرطة ضجة) تحقيق الكفا.......

المناقشة

هنا نقدم بروتوكول للsporulating SK1 الخميرة في شكل multiwell 96. التهوية هي المفتاح للتبوغ كفاءة، الأمر الذي يتطلب استخدام إما بقضيب أو حبة الزجاج في كل بئر. عندما يتم sporulated الخلايا في لوحة multiwell 96 في حاضنة تهتز دون أي حبة أو بقضيب، الخلايا لا sporulate بكفاءة. وينظر فقط زيادة صغيرة في كفاءة تبوغ عندما يتم sporulated الخلايا دون أي حبة أو بقضيب في حاضنة تهتز، مقارنة يجري في 30 درجة مئوية دون التحريض (الجدول 1؛ 17٪ في شاكر مقابل 10٪ المفروضة على ضجة طبق)........

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Nunc 1.3 مل DeepWell Plates	ThermoScientific	260251	المستخدمة في التبوغ
Nunc 2.0 مل DeepWell Plates	ThermoScientific	278743	تستخدم لنمو ما قبل التبويض ، الخطوة 1.2.3
حبة زجاجية 3 مم	فيشر	11-312A	تستخدم في التبوغ
5 مم × 2 مم شريط التحريك ، عبوة من 12	فيشر	14-511-82	تستخدم للتبواغ
96 حسنا frogger	V & P Scientific	VP407	مطلوب للخطوة 1.2
ناسخة المكتبة	V& P Scientific	VP381	مطلوب للخطوة 1.2 ؛ لاستخدامه مع
طبق بتري المستطيل	frogger ThermoScientific	264728	اللازم للخطوة 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	مطلوب لوسائل الإعلام
مستخلص الخميرة	دينار	بحريني 212750	اللازم للوسائط
Bacto Agar	BD	212750	اللازمة للوسائط
Dextrose	فيشر	D16-3	مطلوب للوسائط
أسيتات البوتاسيوم	فيشر	P171-500	اللازمة للوسائط
الجلسرين	فيشر	G33-500	اللازمة للوسائط
أسود 96 بئر لوحة سفلية زجاجية	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	اللازمة للخطوة 2.4