La esporulación eficiente de<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; En un formato de 96 multipocillos

Resumen

Aquí, la esporulación de Saccharomyces cerevisiae se lleva a cabo en un formato de 96 pocillos múltiples.

Resumen

Durante épocas de estrés nutricional, Saccharomyces cerevisiae sufre gametogénesis, conocida como esporulación. Las células de levadura diploides que están hambrientas de nitrógeno y carbono iniciarán el proceso de esporulación. El proceso de esporulación incluye meiosis seguida de formación de esporas, donde los núcleos haploides se empaquetan en esporas resistentes al medio ambiente. Hemos desarrollado métodos para la esporulación eficiente de levadura en gemación en 96 placas de pocillos múltiples, para aumentar el rendimiento de las células de levadura de cribado para fenotipos de esporulación. Estos métodos son compatibles con el cribado con plásmidos que contienen levaduras que requieren selección nutricional, cuando se utilizan medios mínimos adecuados, o con el cribado de levaduras con alteraciones genómicas, cuando se utiliza un régimen de preporulación rico. Encontramos que para este método, la aireación durante la esporulación es crítica para la formación de esporas, y hemos ideado técnicas para asegurar una aireación suficiente que sean compatibles con el formato de placa multipocillo 96. Aunque estos métodos no logran el nivel típico de esporulación de ~ 80% que se puede lograr en experimentos basados en matraces de gran volumen, estos métodos lograrán de manera confiable un nivel de esporulación de alrededor del 50-60% en placas de pocillos múltiples de pequeño volumen.

Introducción

La esporulación en la levadura en ciernes ha sido estudiado para proporcionar información sobre muchos aspectos de la biología, incluyendo el control de la segregación de cromosomas durante la meiosis ^1, los mecanismos de recombinación genética ^2, el control del desarrollo de células de señalización ^3, control nutricional de desarrollo ^4, la transcripción regulación del desarrollo ^5, y el examen de la formación de esporas ^6. La formación de esporas incluye una novela caso la división celular que implica la formación de nuevos compartimentos de membrana dentro de la célula madre seguido de la deposición....

Protocolo

1. Preparación para la esporulación

Nota:. Los medios descritos en este protocolo se realizan utilizando las recetas y los métodos estándar ^13,17 La tabla 1 muestra la formulación de 1 l de los diferentes medios utilizados en este protocolo.

Bacto peptona

Extracto de levadura

Bacto Agar

Resultados

Para evaluar este protocolo, las eficiencias de esporulación obtenidos de esporulación las células en placas de pocillos múltiples (como se describió anteriormente) se compararon a las células esporulados utilizando volúmenes más grandes en matraces (Tabla 2). El uso de placas de múltiples pocillos no alcanzó la alta eficiencia se ve cuando esporulación en frascos, donde la eficiencia ~ 80% se puede ver de forma rutinaria. Esporulación en placas de pocillos múltipl.......

Discusión

Aquí se presenta un protocolo para la esporulación de levadura SK1 en un formato de múltiples pocillos 96. La aireación es clave para la esporulación eficiente, que requiere el uso de cualquiera de una barra de agitación o una perla de vidrio en cada pocillo. Cuando las células son esporulados en una placa de múltiples pocillos 96 en una incubadora de agitación sin ya sea un cordón o una barra de agitación, las células no esporulan eficiente. Sólo un pequeño aumento en la eficiencia de la esporulación se ve cuando se es.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nunc 1,3 ml Placas	DeepWell ThermoScientific 260251		Utilizado para la esporulación
Nunc 2,0 ml Placas DeepWell	ThermoScientific	278743	Se utiliza para el crecimiento de la presporulación, paso 1.2.3
Perla de vidrio de 3 mm	Fisher	11-312A	Utilizada para la esporulación
Barra agitadora de 5 mm x 2 mm, paquete de 12	Fisher	14-511-82	Utilizado para la esporulación
96 pozo frogger	V& P Scientific	VP407	necesario para la
copiadora de biblioteca	V& P Scientific	VP381	necesario para el paso 1.2; para ser utilizado con la
placa de Petri rectangular	Frogger ThermoScientific	264728	necesario para el paso 1.2
Bacto Peptone	BD	211677	necesarios para los medios
Extracto de levadura	BD	212750	necesario para los medios
Bacto Agar	BD	212750	necesarios para los medios
Dextrosa	Fisher	D16-3	necesario para los medios
Acetato de potasio	Fisher	P171-500	necesario para los medios
Glicerol	Fisher	G33-500	necesario para los medios
Placa inferior de vidrio negra de 96 pocillos	MatTek	PBK96G-1.5.5-F	necesaria para el paso 2.4

del paso 1.2