मात्रात्मक, काइनेटिक और उच्च throughput नवोदित खमीर में endocytosis के विश्लेषण के लिए pHluorin के आवेदन
Summary
Accurate quantification of vesicular trafficking events often provides key insights into roles for specific proteins and the effects of mutations. This paper presents methods for using superecliptic pHluorin, a pH-sensitive GFP variant, as a tool for quantification of endocytic events in living cells using quantitative fluorescence microscopy and flow cytometry.
Abstract
हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और इसके वेरिएंट को व्यापक रूप से प्रोटीन स्थानीयकरण और इस तरह cytoskeletal remodeling और जीवित कोशिकाओं में vesicular तस्करी के रूप में की घटनाओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए उपकरणों का इस्तेमाल कर रहे हैं। कैमेरिक GFP fusions का उपयोग कर मात्रात्मक तरीके में कई अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है; हालांकि, कुछ हद तक GFP प्रोटियोलिसिस के लिए प्रतिरोधी है, इस प्रकार अपने प्रतिदीप्ति lysosome / रिक्तिका, जो endocytic मार्ग में माल की तस्करी की मात्रा का ठहराव बाधित कर सकते हैं में बनी रहती है। endocytosis और बाद endocytic की तस्करी की घटनाओं बढ़ाता के लिए एक वैकल्पिक तरीका superecliptic pHluorin, GFP की एक पीएच के प्रति संवेदनशील संस्करण है कि अम्लीय वातावरण में बुझती है का उपयोग करता है। Multivesicular निकायों (MVBs) और lysosome / रिक्तिका लुमेन के लिए वितरण में माल के समावेश पर प्रतिदीप्ति की एक dampening में transmembrane कार्गो प्रोटीन परिणामों के cytoplasmic पूंछ को pHluorin की chimeric संलयन। इस प्रकार, vacuolar प्रतिदीप्ति का शमन quantifi की सुविधाendocytosis और endocytic मार्ग में प्रारंभिक घटनाओं के केशन। इस पत्र के माध्यम से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए pHluorin टैग cargos का उपयोग तरीकों, साथ ही जनसंख्या के आधार पर assays के प्रवाह cytometry का उपयोग का वर्णन करता है।
Introduction
Vesicular की तस्करी organelle पहचान और कोशिकाओं में समारोह को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, और व्यक्तिगत सेलुलर डिब्बों में से प्रोटीन और झिल्ली रचना को विनियमित करने के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र है। प्लाज्मा झिल्ली में, exocytic पुटिकाओं के विलय, कोशिका की सतह पर नए प्रोटीन और झिल्ली बचाता है जबकि endocytosis के माध्यम से उत्पन्न पुटिकाओं बाद रीसाइक्लिंग या lysosome को लक्षित करने के लिए सतह से झिल्ली और प्रोटीन को हटा दें। इस प्रकार, endocytosis पोषक तत्व तेज करने के लिए और बाह्य वातावरण के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण है। Exocytosis और endocytosis प्लाज्मा झिल्ली सतह क्षेत्र को विनियमित करने के लिए, और क्षतिग्रस्त प्रोटीन के कारोबार की अनुमति देने के लिए संतुलित कर रहे हैं।
खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में अध्ययन एन की एक किस्म के जवाब में endocytosis में शामिल प्रोटीन की एक बड़ी संख्या है, साथ ही कई endocytic मार्ग है कि विशिष्ट cargos के internalization को बढ़ावा देने या कि अधिनियम की पहचान की हैvironmental की स्थिति। सबसे अध्ययन मार्ग क्लैथ्रिन की मध्यस्थता endocytosis (सीएमई), जिसमें क्लैथ्रिन और साइटोसोलिक गौण प्रोटीन एक कोट संरचना में इकट्ठा नवजात endocytic पुटिका को स्थिर करने के लिए है। नवोदित खमीर में प्रयोगों की गतिशीलता और कई endocytic प्रोटीन 1-3 के लिए भर्ती के आदेश में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि मिले हैं। विशेष रूप से, सीएमई मशीनरी अत्यधिक विकास के माध्यम से संरक्षित है कि इस तरह के खमीर में सीएमई से संबंधित प्रोटीन का बहुमत मानव orthologs है; इस प्रकार, नवोदित खमीर endocytosis के तंत्र है कि उच्च eukaryotes में संरक्षित कर रहे हैं समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण किया गया है। उदाहरण के लिए, नवोदित खमीर का उपयोग अध्ययन है कि गठन और सीएमई संरचनाओं की परिपक्वता (खमीर के रूप में cortical actin पैच करने के लिए कहा गया है) कई प्रोटीन के अनुक्रमिक भर्ती शामिल है, क्लैथ्रिन और कार्गो बाध्यकारी एडाप्टर प्रोटीन के साथ शुरुआत, अतिरिक्त endocytic सहायक की भर्ती के द्वारा पीछा चुना गया प्रोटीन,Arp2 / 3 की मध्यस्थता actin polymerization की सक्रियता, और पुटिका तराश 1,2 में शामिल प्रोटीन की भर्ती। सीएमई मशीनरी प्रोटीन की भर्ती actin पैच cortical करने के लिए एक उच्च आदेश दिया और टकसाली प्रक्रिया है, और कई प्रोटीन के लिए भर्ती की सटीक आदेश सीएमई मशीनरी के अन्य घटकों के लिए सम्मान के साथ स्थापित किया गया है। महत्वपूर्ण बात है, हाल के अध्ययनों स्तनधारी कोशिकाओं 4 में क्लैथ्रिन लेपित गड्ढ़े में सीएमई प्रोटीन के लिए भर्ती की एक ऐसी ही आदेश की पुष्टि की है।
सीएमई के अलावा, कई प्रकार की कोशिकाओं में एक या अधिक क्लैथ्रिन स्वतंत्र endocytic (सीआईई) रास्ते कि वैकल्पिक तंत्र पर भरोसा प्लाज्मा झिल्ली 5-7 से पुटिका गठन और internalization बढ़ावा देने के लिए मेरे पास है। खमीर में, हम हाल ही में एक सीआईई मार्ग है कि छोटे GTPase Rho1 और उसके सक्रिय गुआनिन न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक (जीईएफ), Rom1 8,9 इस्तेमाल की पहचान की। Rho1 actin polymerization 1 बढ़ावा देने के लिए formin Bni1 को सक्रिय करता है0,11, जो खमीर 12 में क्लैथ्रिन स्वतंत्र endocytosis के इस फार्म के लिए आवश्यक है। इसके अलावा, प्रोटीन की α-arrestin परिवार यूबीक्यूटिन ligase Rsp5 सीएमई 13-17 के माध्यम से माल ubiquitination और बाद में internalization बढ़ावा देने के लिए, और भी सीआईई 18 में शामिल प्रोटीन के साथ सीआईई मार्ग के माध्यम से माल internalization को बढ़ावा देने, संभवतः प्रत्यक्ष बातचीत के माध्यम से भर्ती। सीआईई रास्ते की एक किस्म भी क्लैथ्रिन स्वतंत्र और phagocytic मार्ग है कि Rho1 ortholog, RhoA 9,19 पर भरोसा सहित स्तनधारी कोशिकाओं में मौजूद हैं। स्तनधारी सीआईई में RhoA की भूमिका खराब समझा जाता है; इस प्रकार, नवोदित खमीर में अध्ययन के अतिरिक्त यंत्रवत अंतर्दृष्टि है कि स्तनधारी सीआईई करने के लिए लागू कर रहे हैं प्रदान कर सकता है।
endocytic घटनाओं की सटीक मात्रा का ठहराव endocytosis को विनियमित करने में विशिष्ट प्रोटीन की भूमिकाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, और कार्गो internalization या प्रोग्राम पर परिवर्तन के प्रभाव प्रकट कर सकते हैंendocytic मार्ग के माध्यम से एन। इस प्रयोजन के लिए, जैव रासायनिक तरीकों ligand तेज नजर रखने के लिए या endocytic कार्गो प्रोटीन की गिरावट की दर को मापने के लिए उपयोग किया जा सकता है। जीवित कोशिकाओं में, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और ब्याज की cargos के लिए उसके संस्करण के विलय माल परिवहन के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है। हालांकि, GFP टैग cargos endocytosis की मात्रा का ठहराव के लिए सीमित उपयोग के हैं क्योंकि GFP (खमीर में या रिक्तिका) लाइसोसोम में गिरावट के लिए प्रतिरोधी है। इसके अलावा, GFP प्रतिदीप्ति केवल आंशिक रूप से पीएच में परिवर्तन के प्रति संवेदनशील है, और 20,21 लुमेन रिक्तिका भीतर detectable बनी हुई है। नतीजतन, GFP टैग की प्रतिदीप्ति रिक्तिका में बनी रहती है लंबे समय के बाद माल के शेष अपमानित किया गया है, और माल तीव्रता के पूरे सेल आधारित मात्रा का ठहराव रिक्तिका में लंबी अवधि GFP प्रतिदीप्ति के कारण गलत हो सकता है।
आदेश vacuolar GFP प्रतिदीप्ति की खामियों को दूर करने के लिए हम पहले से superecliptic पीएच का इस्तेमाल कियाluorin, GFP की एक पीएच के प्रति संवेदनशील संस्करण है कि तटस्थ पीएच पर चमकते fluoresces, लेकिन इस तरह के कोटर / 20,22,23 lysosome के लुमेन के रूप में अम्लीय वातावरण में प्रतिदीप्ति खो देता है। Endocytic cargos के cytoplasmic पूंछ पर एक pHluorin टैग लगाना प्लाज्मा झिल्ली में है और जल्दी endosomes, जहां pHluorin टैग कोशिका द्रव्य (चित्रा 1 ए) के संपर्क में रहता है पर cargos के दृश्य परमिट। जल्दी endosomes परिपक्व, endosomal छँटाई जटिल पुटिकाओं कि इंडो सोम की लुमेन में कली में परिवहन (ESCRT) मशीनरी संकुल सतह स्थानीय cargos के लिए आवश्यक है, पैदा Multivesicular निकायों (MVBs) के रूप में 24। cargos कि आंतरिक MVB पुटिकाओं में शामिल किया गया है, pHluorin टैग पुटिका लुमेन की ओर चेहरे। आंतरिक MVB पुटिकाओं अम्लीय कर रहे हैं; इस प्रकार, pHluorin टैग cargos जल्दी endosomes पर प्रतिदीप्ति खो के रूप में वे MVBs 20 में परिपक्व। रिक्तिका साथ MVB के बाद संलयन MVB ल्यूमिनल सामग्री बचाता हैगिरावट के लिए, और pHluorin टैग रिक्तिका लुमेन के अम्लीय वातावरण में बुझती रहते हैं।
इस पत्र में खमीर cytoplasmic pHluorin टैग के साथ cargos का उपयोग कर मात्रात्मक endocytic assays के विस्तृत विवरण प्रदान करता है। pHluorin टैग cargos व्यक्त तनाव, काइनेटिक और / या समापन बिंदु assays में इस्तेमाल किया जा सकता गुण और तस्करी विशिष्ट माल के व्यवहार पर निर्भर करता है। इसके अलावा, कुछ pHluorin टैग cargos से फ्लो सहित उच्च throughput विश्लेषण के तरीकों, के लिए उत्तरदायी हैं। महत्वपूर्ण बात है, pHluorin टैग, जीवित कोशिकाओं में endocytic घटनाओं का अध्ययन endocytosis और जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती उपभेदों में endocytic समारोह की तुलना की मात्रा का ठहराव की अनुमति के लिए एक बहुमुखी उपकरण है।
Protocol
Representative Results
Discussion
खमीर कोशिकाओं में endocytic घटनाओं की मात्रा का ठहराव के लिए pHluorin के आवेदन transmembrane cargos जिसमें फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन (चित्रा 1 ए) के cytoplasmic पूंछ से जुड़े हुए है का उपयोग करता है। यहाँ वर्णित assays के लिए, cargos जब pHluorin ट?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Gero Miesenböck and Tim Ryan for sharing pHluorin cDNA used to generate reagents in this study, Nathan Wright, Joanna Poprawski and Lydia Nyasae for excellent technical assistance, members of the Wendland lab for helpful discussions, and Michael McCaffery and Erin Pryce at the Integrated Imaging Center (Johns Hopkins) for advice and assistance with microscopy and flow cytometry. This work was supported by grants from the National Institutes of Health (to B.W., GM60979) and the National Science Foundation (to B.W., MCB 1024818). K.W. was supported in part by a training grant from the National Institutes of Health (T32-GM007231). A.F.O. was supported by developmental funds from the Department of Biological Sciences at Duquesne University and National Science Foundation CAREER grant 553143.
Materials
| Adenine | Sigma | A8626-25G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Bacto-agar | Fisher | BP1423-2 | Use for preparation of plate media |
| BD Difco Yeast Nitrogen Base (without amino acids) | BD | 291920 | Use for preparation of liquid and plate media |
| Concanavalin A | Sigma | C5275-5MG | Use for coating of chamber slides |
| Dextrose | Fisher | BP350-1 | Use for preparation of liquid and plate media |
| L-Histidine | Fisher | BP382-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Leucine | Acros | 125121000 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Lysine | Fisher | BP386-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Methionine | Fisher | BP388-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tryptophan | Fisher | BP395-100 | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| L-Tyrosine | Acros | 140641000 | Use for preparation of amino acid mixture |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass (8-well) | Thermo Scientific | 155411 | Use for kinetic and endpoint assays of Mup1-pHluorin internalization |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | Use for preparation of amino acid mixture and stock solution |
| Axiovert 200 inverted microscope | Carl Zeiss | Custom Build | |
| 100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Objective Lens | Carl Zeiss | Objective should be 100X, 1.4NA or higher | |
| Sensicam | Cooke Corporation | Camera should have 12-bit or higher dynamic range | |
| X-Cite 120PC Q Illumination Source | Excelitas Technologies | ||
| Slidebook 5 software | Intelligent Imaging Innovations | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
References
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