Os linfócitos são os principais atores nas respostas imunes adaptativas. Aqui, apresentamos um protocolo de purificação de linfócitos para determinar as funções fisiológicas das moléculas desejadas na ativação de linfócitos in vitro e in vivo. Os procedimentos experimentais descritos são adequados para comparar as capacidades funcionais entre linfócitos controle e geneticamente modificados.
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Artigo de método
Isolamento e Activação de Linfócitos murinos
Neste artigo
Resumo
Resumo
células B e T, com seus repertórios de antígeno-receptor extremamente diversos, têm a capacidade de montar respostas imunes específicas contra quase qualquer patógeno invasor1,2. Compreensivelmente, essas habilidades intrincadas são controladas por um grande número de moléculas envolvidas em vários processos celulares para garantir respostas imunes oportunas e espacialmente reguladas3. Aqui, descrevemos procedimentos experimentais que permitem o isolamento rápido de linfócitos murinos altamente purificados usando a tecnologia de classificação magnética de células. Os linfócitos purificados resultantes podem então ser submetidos a vários ensaios funcionais in vitro ou in vivo, como a determinação da capacidade de sinalização de linfócitos após estimulação por immunoblotting4 e a investigação de habilidades proliferativas por incorporação de 3H-timidina ou marcação de éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE)5-7. Além de comparar as capacidades funcionais de linfócitos controle e geneticamente modificados, também podemos determinar a capacidade estimulatória de células T de células apresentadoras de antígenos (APCs) in vivo, conforme mostrado em nossos resultados representativos usando células T OT-I marcadas com CFSE transplantadas.
Introdução
Os linfócitos maduros geralmente existem no estado de repouso se não houver infecção ou inflamação pré-existente no indivíduo. Portanto, é importante manter o status ingênuo dos linfócitos durante o processo de isolamento antes de realizar ensaios funcionais in vitro ou in vivo. A chave para garantir resultados consistentes e reprodutíveis é limitar qualquer manipulação desnecessária das células.
A classificação magnética de células utiliza anticorpos e microesferas para rotular as células, de modo a enriquecer a população de células de interesse. Com essa abordagem, existem duas estratégias de purificação: enriquecimento....
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Protocolo
Todos os ratos são criados e mantidos sob condições específicas livres de patógenos e todos os protocolos do mouse são conduzidos de acordo com as diretrizes da Comissão Cuidado e Uso Institucional Animal.
1. Preparação de Tampões e reagentes
- Prepare completa do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) meio (10% de soro inactivado por calor de bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina, penicilina (100 UI / mL) / estreptomicina (100 ug / ml), 55 uM de 2-mercaptoetanol ).
- Prepare 20x solução salina equilibrada (BSS) Stock 1 e da 2, separadamente.
- Prepare 20x BSS Estoque 1 (111 mM dextrose, fosfato de potássio 8,8 m....
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Resultados
purificação magnética de células de linfócitos permite que os utilizadores para purificar uma população de células alvo num período relativamente curto de tempo. Utilizando o nosso protocolo de esgotamento, que foram capazes de aumentar a percentagem de células T CD8 (OT-I em recombinação-activação do gene-1 (RAG-1) -deficient ratinhos) a partir de 72,8% (antes da purificação) a 94,2% (após purificação; Figura 1A) 4,5. Estes linfócitos purificadas podem então .......
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Discussão
Neste protocolo, demonstramos um procedimento para a purificação de linfócitos de órgãos linfóides. purificação celular utilizando esférulas magnéticas triagem é um método rápido e simples que produz células alvo viáveis, altamente purificados.
Passos críticos dentro do Protocolo
A viabilidade celular e rendimento celular
Mantendo a viabilidade das células de linhagem hematopoiéticas in vitro é fundamental para.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
O estudo é apoiado pelo Ministério da Educação, Singapore (ACRF Tier1-RG40 / 13 e Tier2-MOE2013-T2-2-038). O manuscrito foi editado por Amy Sullivan de Obrizus Communications.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Materiais | |||
| RPMI 1640 (sem L-Glutamina) | Gibco | 31870025 | |
| Soro | Inativado por Calor | ||
| L-glutamina | Gibco | 25030024 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Gibco | 15140114 | |
| 2-mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | |
| Microesferas magnéticas anti-CD43 | Miltenyi Biotec | 130-049-801 | Misturar bem o uso prévio |
| de estreptavidina | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | Misturar bem o uso prévio |
| Contas magnéticas anti-anexina V | Miltenyi Biotec | 130-090-201 | Misture bem o uso prévio |
| MACS LD | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Placa de cultura estéril de fundo em U de 96 poços | Greiner Bio-one | 650180 | |
| Placa de cultura estéril de fundo em F de 96 poços | Greiner Bio-one | 655180 | |
| 100 μ malha | Para esterilizar usando radiação UV uso prévio | ||
| 0,2 μ m unidades de filtro descartáveis estéreis | Nalgene | 567-0020 | Pode ser substituído por qualquer dispositivo de filtro estéril |
| CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | CTV para abreviar; alternativa ao CFSE |
| CellTrace Yellow | Invitrogen | C34567 | CTY para abreviar; alternativa ao CFSE |
| CellTrace Far Red | Invitrogen | C34564 | CTFR para abreviar; alternativa ao CFSE |
| Corante de proliferação celular eFluor 670 | eBioscience | 65-0840 | CPD670 para abreviar; alternativa para CFSE |
| PKH26 | Sigma Aldrich | PKH26GL | PKH26, alternativa para CFSE |
| strong>Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
| Chemicals | |||
| Dextrose | Sigma Aldrich | G7021 | |
| Fosfato de potássio monobásico | Sigma Aldrich | P5655 | |
| Fosfato de sódio dibásico | Sigma Aldrich | S5136 | |
| Vermelho de fenol | Sigma Aldrich | P0290 | |
| Cloreto de cálcio di-hidratado | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Cloreto de potássio | Sigma Aldrich | P5405 | |
| Cloreto de sódio | Merck Millipore | S7653 | Pode ser usado de outras fontes |
| Cloreto de magnésio hexahidratado | Sigma Aldrich | M2393 | |
| Sulfato de magnésio | Sigma Aldrich | M2643 | |
| Cloreto de amônio | Sigma Aldrich | A9434 | |
| Tris-base | |||
| Dimetil Sulfóxido | Sigma Aldrich | D8418 | |
| (5- (e 6-) éster succinimidílico de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE) | Sondas moleculares | C-1157 | Reconstituem em DMSO |
| Phorbol 12,13-dibutirato (PBDU, éster de forbol) | Sigma Aldrich | P1269 | |
| A23187 (ionóforo de cálcio) | Sigma Aldrich | C7522 | |
| < strong > Nome < / strong > | Empresa < / strong> | Número de catálogo | Comentários |
| Anticorpos e proteína recombinante | |||
| CD11b biotina (clone m1/70) | Biolegend | 101204 | coquetel de depleção de células T |
| CD11c biotina (clone N418) | Biolegend | 117304 | coquetel de depleção de células T |
| Gr-1 (clone RB6-8C5) | Biolegend | 108404 | coquetel de depleção de células T |
| Ter119 biotina (clone Ter119) | Biolegend | 116204 | coquetel de depleção de células T |
| TCR-&gama; δ biotina (clone GL-3) | Biolegend | 118103 | coquetel de depleção de células T |
| CD19 biotina (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | coquetel de depleção de células T |
| B220 biotina (clone RA3-6B2) | Biolegend | 103204 | coquetel de depleção de células T |
| CD49b biotina (clone DX5) | Biolegend | 108904 | coquetel de depleção de células T |
| CD4 biotina (clone GK1.5) | Biolegend | 100404 | Coquetel de depleção de células T |
| CD8 Biotina (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | Coquetel de depleção de células T |
| F(ab')2 IgM anti-rato para cabras (revestidas com placa) | Jackson ImmunoResearch | 115-006-075 | 50 µ l/well para revestimento (96-well) |
| Anti-mouse CD40 mAb (revestido com placa) | Pharmingen | 553722 | 50 µ l/well para revestimento (96-well) |
| Recombinante IL-4 | ProSpec | Cyt-282 | |
| LPS de E. coli Sorotipo 055:B5 | Sigma Aldrich | L-4005 | |
| Anti-CD3 (clone clone OKT3) (revestido em placa) | eBioscience | 16-0037-85 | 50 µ l/poço para revestimento (96 poços) |
| Anti-CD28 (clone clone 37.51) (revestido com placa) | eBioscience | 16-0281-85 | 50 µ l/poço para revestimento (96 poços) |
| Albumina recombinante IL-2 | ProSpec | Cyt-370 | |
| de clara de ovo de galinha, Ovalbumina | Sigma Aldrich | A7641 |
Referências
- Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
- LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
- Brownlie, R., Zamoy....
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Reimpressões e permissões
