In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.
Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.
प्रसव पूर्व निदान आनुवंशिक रोगों (यानी गुणसूत्र aberrations, monogenetic या multifactorial polygenetic / बीमारियों) और जन्मजात विकृतियों (यानी जन्मजात diaphragmatic हर्निया, पित्ताशय फेफड़ों के घावों, exomphalos, gastroschisis) का मूल्यांकन करने के लिए एक महत्वपूर्ण नैदानिक उपकरण है। एमनियोटिक द्रव (वायुसेना) कोशिकाओं गर्भावस्था की दूसरी तिमाही के दौरान नियमित रूप से अनुसूचित प्रक्रियाओं से प्राप्त करने के लिए सरल (यानी amniocentesis और amnioreduction) या शल्यक्रिया वर्गों 1, 2 हैं। जन्म के पूर्व या नवजात रोगियों से वायुसेना कोशिकाओं की उपलब्धता पुनर्योजी चिकित्सा के लिए इस स्रोत का उपयोग करने की संभावना प्रदान करता है, और कई शोधकर्ताओं ने विभिन्न ऊतकों को नुकसान या बीमारियों एक स्टेम सेल वायुसेना 3, 4, 5, 6 से पृथक आबादी का उपयोग कर इलाज के लिए संभावना की जांच, 7, 8, 9, 10, 11, 12। आसानी से रोगग्रस्त रोगियों से वायुसेना कोशिकाओं को प्राप्त करने, एक समय खिड़की में जो बीमारी अक्सर स्थिर है की संभावना है, reprogramming प्रयोजनों के लिए इस सेल के स्रोत का उपयोग करने के विचार के लिए रास्ता खुल जाता है। दरअसल, प्रेरित pluripotent स्टेम (आईपीएस) कोशिकाओं वायुसेना कोशिकाओं से व्युत्पन्न, इन विट्रो दवा के परीक्षण के लिए या ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण के लिए ब्याज की कोशिकाओं में भेदभाव किया जा सका आदेश बच्चे के जन्म से पहले एक पर्याप्त रोगी विशेष चिकित्सा तैयार करने में। कई अध्ययनों से पहले ही दिखा दिया है वायुसेना कोशिकाओं की क्षमता reprogrammed और भेदभाव किया जा करने के लिए सेल प्रकार 13, 14, 15, 16, 17 <की एक विस्तृत श्रृंखला में/ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27।
चार प्रतिलेखन कारक (Oct4, Sox2, cMyc और Klf4) के लिए मजबूर अभिव्यक्ति के माध्यम से ताकाहाशी और reprogrammed दैहिक कोशिकाओं के यामानाका 28 से खोज के बाद से, प्रगति reprogramming के क्षेत्र में किया गया है। विभिन्न तरीकों को देखते हुए, हम वायरल और गैर-वायरल दृष्टिकोणों के बीच भेद कर सकते हैं। पहले वायरल वैक्टर (रेट्रोवायरस और lentiviruses) है, जो उच्च दक्षता लेकिन दोनों एक आंशिक रूप से reprogrammed सेल लाइन का परिणाम और के जोखिम के साथ रेट्रोवायरल transgene की आमतौर पर अधूरा मुंह बंद करने, राशि के उपयोग की उम्मीदइन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस 29, 30, 31। यानी plasmids, वैक्टर, mRNA, प्रोटीन, transposons: गैर वायरल विधि विभिन्न रणनीतियों का उपयोग करता है। आईपीएस कोशिकाओं ट्रांसजेनिक दृश्यों का नि: शुल्क की व्युत्पत्ति टपकाया transgene अभिव्यक्ति और इन्सर्शनल mutagenesis के हानिकारक प्रभावों को दरकिनार करने के लिए करना है। उपर्युक्त सभी गैर वायरल रणनीतियों के अलावा, PiggyBac (पंजाब) transposon / Transposase प्रणाली एक transgene और Transposase एंजाइम की क्षणिक अभिव्यक्ति प्रविष्टि या छांटना घटनाओं 32 उत्प्रेरित करने flanking केवल उल्टे टर्मिनल दोहराता की आवश्यकता है। आईपीएस सेल पीढ़ी के लिए अन्य तरीकों पर transposons का उपयोग करने में लाभ एक गैर वायरल वेक्टर दृष्टिकोण है कि रेट्रोवायरल वैक्टर का एक ही दक्षता से पता चलता है के साथ वेक्टर मुक्त आईपीएस कोशिकाओं प्राप्त करने की संभावना है। इस reprogr के लिए एकीकृत transposon एन्कोडिंग का पता लगाने के कम छांटना द्वारा ही संभव हैआईपीएस कोशिकाओं 33 में Transposase की एक नई क्षणिक अभिव्यक्ति निम्नलिखित कारकों amming। यह देखते हुए कि पंजाब विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 34, 35, 36, 37 में कुशल है, वायरल वैक्टर के लिए सम्मान के साथ एक नैदानिक दृष्टिकोण के लिए अधिक उपयुक्त है, और वर्तमान वायरल उत्पादन प्रोटोकॉल है कि जीनोबायोटिक का उपयोग करने के विपरीत Xeno मुक्त आईपीएस कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देता है शर्तों, इस प्रणाली murine वायुसेना से आईपीएस कोशिकाओं प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है।
यहाँ हम पहले से ही प्रकाशित काम के बाद माउस वायुसेना कोशिकाओं (आईपीएस वायुसेना कोशिकाओं) 38 से pluripotent आईपीएस क्लोन के उत्पादन को दिखाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का प्रस्ताव।
विधि pluripotency की प्रेरण प्राप्त करने के लिए चुना लंबी अवधि के प्रत्यारोपण के संबंध में सेल नैदानिक सुरक्षा के लिए प्रासंगिक है। आजकल, वहाँ reprogramming के लिए उपयुक्त कई तरीके हैं। गैर-एकीकृत तरीकों के अलावा, स?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by CARIPARO Foundation Grant number 13/04 and Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza Grant number 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin and Michela Pozzobon are funded by Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin is funded by CARIPARO Foundation Grant number 13/04. Paolo De Coppi is funded by Great Ormond Street Hospital Children’s Charity.
100 mm Bacterial-grade Petri Dishes | BD Falcon | 351029 | For in vitro differentiation |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Alexa568-conjugated goat anti-mouse IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alexa594-conjugated chicken anti-goat IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alexa594-conjugated chicken anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alexa594-conjugated goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Secondary antibody (immunofluorescence) |
Alkaline Phosphatase kit | Sigma | 85L1 | Alkaline Phosphatase staining |
Ampicillin | Sigma | A0166 | For bacterial selection |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906 | BSA, for blocking solution. Diluted in PBS 1X |
Chloroform | Sigma | C2432 | For RNA extraction |
DH5α cells | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Bacteria for cloning procedure |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Doxycycline | Sigma | D9891 | For exogenous factors expression |
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Sarstedt | 72.706 | For PB production |
ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | For MEF medium |
Fine point forceps | F.S.T | Dumont #5 | AF isolation |
Gelatin | J.T.Baker | 131 | Used 0.1%, diluted in PBS 1X |
Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | For blocking solution. Diluted in PBS 1X |
Haematoxylin QS | Vector Laboratories | H3404 | Nuclei detection |
HE | Bio-Optica | 04-061010 | Histological analysis of teratoma |
Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Nuclei detection |
Horse Serum | Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | For blocking solution |
HRP-conjugated goat anti-mouse IgG | SantaCruz | sc2005 | Secondary antibody (immunoperoxidase) |
ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Peroxidase substrate |
Insulin syringe with needle (25G) | Terumo | SS+01H25161 | Amniocentesis procedure |
Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Rabbit polyclonal IgG |
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
LB broth (Lennox) | Sigma | L3022 | For bacterial growth |
LIF | Sigma | L5158 | For mouse AF and iPS-AF cells medium |
Matrigel | BD | 354234 | For in vitro differentiation. Diluted 1:10 in DMEM |
Methanol | Sigma | 32213 | Peroxidase blocking |
MULTIWELL 24 well plate | BD Falcon | 353047 | For in vitro differentiation |
MULTIWELL 6 well plate | BD Falcon | 353046 | For MEF, mouse AF and iPS-AF cells culture |
Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | Rabbit polyclonal IgG |
Non-essential amino acids | Sigma | M7145 | For mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | For blocking solution. Diluted in PBS 1X |
NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | For cell permeabilization. Diluted in PBS 1X |
Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | Mouse monoclonal IgG2b |
Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | For RT-PCR |
Paraformaldehyde (solution) | Sigma | 441244 | PFA, fixative, diluted in PBS |
PBS 10X | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, free of Ca2+/Mg2+. Diluted with sterile water to obtain PBS 1X |
Penicillin – Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | For MEF, mouse AF, iPS-AF cells and differentiation medium |
Petri Dish (150mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF culture, tissue culture |
PiggyBac transposase expression plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | – | mPBase |
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | – | PB-tetO2-IRES-OKMS |
QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | For plasmids purification |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | For plasmids purification |
Reverse tetracycline transactivator transposon plasmid | Provided by professor Andras Nagy laboratory | – | rtTA |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74134 | For RNA extraction |
Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | Goat polyclonal IgG |
SSEA1 | Abcam | ab16285 | Mouse monoclonal IgM |
SuperScript II Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | For RT-PCR |
T | Abcam | ab20680 | Rabbit polyclonal IgG |
Taq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Cell culture passaging |
Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1X |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | For RNA extraction |
Tubb3 | Promega | G712A | Mouse monoclonal IgG1 |
TWEEN-20 | Sigma | P1379 | For cell permeabilization, diluted in PBS 1X |
αfp | R&D Systems | MAB1368 | Mouse Monoclonal IgG1 |
αSMA | Abcam | ab7817 | Mouse Monoclonal IgG2a |
Transfection Reagent (FuGENE HD) | Promega | E2311 | For AF cells transfection |
Stereomicroscope | Nikon | SM2645 | To perform amniocentesis |
200 ul tips | Sarstedt | 70.760012 | To pick bacteria colonies |
Scissor | F.S.T | 14094-11 stainless 25U | To perform amniocentesis |
Ethanol | Sigma | 2860 | To clean the abdominal wall of the pregnant dam |
Tissue culture petri dish (150 mm) | BD Falcon | 353025 | For MEF expansion |
Mitomycin C | Sigma | M4287-2MG | For MEF inactivation |
MULTIWELL 96 well plate | BD Falcon | 353071 | For iPS-AF culture |