Этот протокол показывает, как выполнить цельноклеточной записи патч зажим на нейроны сетчатки из плоского монтажа подготовки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Патч зажим Запись Starburst амакриновые клетки в плоскопанельных горе Подготовка деафферентированной Mouse Retina
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Сетчатка млекопитающее представляет собой слоистую ткань состоит из нескольких типов нейронов. Чтобы понять, как визуальный сигналы обрабатываются в пределах своей сложной синаптической сети, электрофизиологические записи часто используются для изучения связи между отдельными нейронами. Мы оптимизировали препарат плоским крепление для патч зажим записи генетически маркированных нейронов в обоих GCL (слой ганглиозных клеток) и INL (внутренний ядерный слой) сетчаток мыши. Запись INL нейронов в плоских монтирует отдается предпочтение по сравнению ломтиками, потому как вертикальные, так и боковые соединения сохраняются в предыдущей конфигурации, позволяя схемы сетчатки глаза с большими боковыми компонентами, которые будут изучены. Мы использовали эту процедуру, чтобы сравнить ответы зеркально-Partnered нейронов в сетчатке, таких как холинергических звездообразования амакринных клеток (мешочков).
Введение
Как легкодоступная часть центральной нервной системы, сетчатка на протяжении десятилетий была полезной моделью в исследованиях в области нейробиологии. Генетическая маркировка нейронов позволила детально охарактеризовать синаптические связи в сетчатке. Благодаря множеству доступных методологий для изучения функции и морфологии нейронов сетчатки, техника записи с помощью патч-зажима сыграла важную роль в нашем современном понимании вертикально передаваемых сигналов в сетчатке. Эти сигналы исходят от поглощения фотонов фоторецепторами и направляются в зрительные центры мозга через спайковые ганглиозные клетки сетчатки (РГК). Несмотря на большой объем знаний, накопленных....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этическое одобрение - процедуры, связанные с субъектов животных были проведены в соответствии с нормами и правилами Национальных институтов здравоохранения руководящих принципов для исследований животных, утвержденные институциональном ухода за животными и использовать комитет из Медицинского колледжа Бэйлора.
1. Внешние и внутренние решения
- Используйте раствор Рингера млекопитающих во время рассечения сетчатки глаза и в качестве внешнего решения в последующем электрофизиологические записи. Приготовьте раствор Рингера млекопитающих от 10x маточного раствора (без кальция) в день записи, а также добавлять CaCl 2 по каплям через 15 мин carb....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Типичные записи балансовые и УКД OFF-типа от деафферентированной сетчатки мыши показаны на рисунке 1. Холинергических клеток в обоих GCL и INL может быть надежно идентифицированные tdTomato флуоресценции и , предназначенные для целых клеток записи патч зажим под DIC (Рисунок 1А) выявить колебания их мембранных потенциалов (верхние следы) и синаптических токов , которые управляют его (нижние следы, рис 1б). Ингибирующие и возбуждающие син.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Многие лаборатории зафиксировали от GCL нейронов в квартире монтажа подготовки 15-18, но наши процедуры позволяют записи из INL нейронов. Настоящим выделить несколько шагов, которые имеют решающее значение для успешного проведения рутинных записей.
Свежесть и плоскостность сетчатки имеют большое значение для проникновения в его пипеткой записи. В связи с этим, фирма прикрепление сетчатки к пробитой нитроцеллюлозные мембраны имеет первостепенное значение и достигается за счет перех.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Благодарим Чжун Чана и Синь Гуаня за техническую помощь. Мы благодарим доктора Рори Маккуистона из Университета Содружества Вирджинии за создание нашей первой установки для патч-хомутов и советы по экспериментальным процедурам. Мы благодарим доктора Самуэля Ву за предложения по записи напряжения. Работа поддерживается грантами NIH EY013811, EY022228 и грантом A Vision Core EY002520. C-KC является заведующей кафедрой Фонда исследования сетчатки Элис Р. Макферсон в Медицинском колледже Бейлора.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Стационарный флуоресцентный микроскоп с DIC | Olympus | BX51-WI | |
| Микроманипуляторы | Sutter | MP-225 | |
| Патч-усилитель с зажимом | A-M System | AM2400 | |
| AD преобразователь | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Контроллер нагревателя | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline нагреватель | Warner Instrument | SC-20 | |
| Перистальтический насос | Rainin | Dynamax | |
| пипетка | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Стеклянная трубка с нитью накала | King Precision Glass | Индивидуальный | |
| стимулятор | A.M.P.I. | Master-8 | |
| Биоцитин | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-глюкоза | Sigma | G6152 | |
| K-глюконат | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-метансульфонат | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Шприцевой фильтр | Nalgene | 171 | |
| 1 мл шприц | Rainin | ||
| 10 μ l наконечник для пипетки | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidin-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
Ссылки
- Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
- Gregg, R. G., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
