मानव endothelial-Pericyte इंटरेक्शन माउस में मैट्रिक्स जेल प्लग परख का उपयोग के vivo अध्ययन में
Summary
हम मैट्रिक्स जेल प्लग angiogenesis परख के विभिन्नता का उपयोग कर माउस में मानव endothelial-pericyte बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।
Abstract
Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.
Introduction
एंजियोजिनेसिस प्रक्रिया है जिसके द्वारा नए रक्त वाहिकाओं कई सामान्य विकास से बीमारी को लेकर क्षेत्रों में एक पूर्व मौजूदा संवहनी नेटवर्क 1 से बनते हैं और चल रहे अनुसंधान का ध्यान केंद्रित है। इस गतिशील प्रक्रिया प्रसार और endothelial कोशिकाओं (ईसीएस) और pericytes एक नाड़ी ट्यूब कि साइट है कि ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की डिलिवरी 2 की जरूरत की ओर निर्देशित है का निर्माण करने की भर्ती के पलायन शामिल है। अध्ययन करने के लिए इस प्रक्रिया को एक समान रूप से गतिशील परख, सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि एक ट्यूब गठन के तीन आयामी प्रकृति पुनरावृत्ति कर सकते हैं की आवश्यकता है। इन विट्रो में 3 डी मैट्रिक्स assays इस जरूरत को संबोधित करने के लिए विकसित किया गया है और अच्छी तरह से काम किया है शोधकर्ताओं स्थान और समय में असतत चरणों में जो angiogenesis 3 जगह, 4, 5, 6 लेता है परिभाषित करने के लिए अनुमति देने के लिए। हालांकि, इन विट्रो में 3 डी मैट्रिक्स मॉडल गैर-भरकर रखा वाहिकाओं एक अध्ययन करने के लिए सीमित कर रहे हैंडी इसलिए angiogenesis प्रक्रिया के लिए प्रासंगिक महत्वपूर्ण घटक की कमी है (जैसे, संवहनी बिस्तर भर में विकास और निरोधात्मक कारकों, अप्राकृतिक तनाव / बलों घूम) और असफल रहते ऊतक में मौजूद जटिल माहौल अनुकरण। इस सीमा को संबोधित करने के लिए, कई विवो angiogenesis assays विकसित किया गया है 7, मैट्रिक्स जेल प्लग परख जो हमारी रिपोर्ट 8, 9 का ध्यान केंद्रित किया जाएगा शामिल है।
मैट्रिक्स जेल प्लग परख एक अच्छी तरह से स्थापित इन विवो angiogenesis परख है कि शोधकर्ताओं के लिए अपील के रूप में यह angiogenesis में अलग कक्षों और पदार्थों की भूमिकाओं का परीक्षण करने के लिए एक मजबूत मंच प्रदान करता है। मैट्रिक्स जेल एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तहखाने झिल्ली समाधान है कि Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस सार्कोमा सेल लाइन है कि 37 डिग्री सेल्सियस पर एक जेल की तरह सामग्री में solidifies द्वारा स्रावित होता है। मैट्रिक्स जेल में इस तरह वृद्धि कारक है, और Inje के रूप में कोशिकाओं और / या पदार्थ, के साथ मिलाया जा सकता हैमाउस में subcutaneously cted। मेजबान ईसीएस 14 दिनों में प्लग आक्रमण करेंगे, एक संवहनी नेटवर्क के रूप में, और मेजबान के खून से भरकर रखा हो जाते हैं। तिथि करने के लिए, मैट्रिक्स जेल प्लग assays के लिए विशेष रूप से angiogenesis के दौरान endothelial सेल व्यवहार के अध्ययन पर, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा कोई प्रयास अभी तक बना दिया गया है निर्धारित करने के लिए इस परख करने के लिए सह-संस्कृति endothelial कोशिकाओं और pericytes इस्तेमाल किया जा सकता है कि क्या ध्यान केंद्रित किया है हालांकि, कैसे इन दो प्रकार की कोशिकाओं angiogenesis के दौरान बातचीत का अध्ययन। विशेष रूप से, ईसीएस और pericytes के बीच के रिश्ते को समझने के रोगों जहां रक्त वाहिका नुकसान वैकृत है, microvascular ischemia और परिधीय रोग 10, 11, 12 सहित अध्ययन के लिए मूल्यवान है।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि मानव ईसीएस और fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) के साथ मैट्रिक्स जेल मिश्रण करने के लिए मानव व्युत्पन्न pericytes परिचय का वर्णन है। इस मिश्रण को तो subcutaneously मैं इंजेक्शन जा सकता हैn SCID चूहों की पीठ पूरी तरह कार्यात्मक, pericyte लेपित, संकर वाहिकाओं के गठन की अनुमति है। हमारी प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मैट्रिक्स जेल के साथ या मानव pericytes, एस.सी.आई.डी चूहों और कैसे महत्वपूर्ण angiogenesis समापन के लिए histological वर्गों का विश्लेषण करने में प्लेसमेंट के बिना मानव ईसीएस युक्त प्लग तैयार करने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
मैट्रिक्स जेल प्लग परख angiogenesis, विवो में एन्जियोजेनिक और antiangiogenic यौगिकों में जीन विनियमन का मूल्यांकन करने के लिए, और इन विट्रो परीक्षण के पूरक के लिए एक सुविधाजनक और शक्तिशाली विधि साबित हो गया है। ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. K. Yuan was supported by an American Heart Association Scientist Development Grant (15SDG25710448) and the Pulmonary Hypertension Association Proof of Concept Award (SPO121940). Dr. V. de Jesus Perez was supported by a career development award from the Robert Wood Johnson Foundation, an NIH K08 HL105884-01 award, a Pulmonary Hypertension Association Award, a Biomedical Research Award from the American Lung Association and a Translational Research and Applied Medicine award from Stanford University.
Materials
| PBS (Phosphate buffered saline) | Corning | 21-031-CV | |
| 0.25% Trypsin/0.53mM EDTA | Corning | 25-053-CI | |
| Endothelial Cell Media (ECM) kit | Sciencell | 1001 | includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| Pericyte Media (PM) kit | Sciencell | 1201 | includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing |
| primary human pulmonary microvascular endothelial cells | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4 | |
| primary human pulmonary pericytes | Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative | this cell type is not available commercially, but brain paricytes are. Cells used at passage 1-4 | |
| bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) | Peprotech | 100-18B | stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | BD | 356237 | |
| 28G 1cc Insluin Syringe | BD | 329410 | |
| SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice | The Jackson Laboratory | 5557 | NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age |
| 1.5mL microcentrifuge tubes, sterile | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL screw top tubes, sterile | BD Biosciences | 352096 | |
| PAP pen | Life Technologies | 8899 | |
| hemocytometer | ThermoFisher Scientific | 02-671-6 | |
| Nair hair removal cream | Walmart | ||
| anti-human CD31 primary antibody | LifeSpan Biosciences | LS-B4737 | working solution is 1:50 |
| anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody | Sigma | C6198 | working solution is 1:300 |
| goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green | ThermoFisher Scientific | A-11008 | working solution is 1:250 |
| Prolong Gold DAPI solution | Cell Signaling | 8961S | |
| microscope slides | VWR | 48300-047 | |
| no. 1.5 cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-544-D | |
| citrate buffer 10x | Millipore | 21545 | |
| extra fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Formalin (paraformaldehyde) | Thermo Fisher Scientific | 245-685 | |
| Tissue cassettes | Simport | M492-12 | |
| goat serum | Dako | X0907 |
References
- Risau, W. Mechanisms of angiogenesis. Nature. 386 (6626), 671-674 (1997).
- Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The role of pericytes in angiogenesis. Int J Dev Biol. 55 (3), 261-268 (2011).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 83-101 (2008).
- Liu, Y., Senger, D. R. Matrix-specific activation of Src and Rho initiates capillary morphogenesis of endothelial cells. FASEB J. 18 (3), 457-468 (2004).
- Grant, D. S., et al. Interaction of endothelial cells with a laminin A chain peptide (SIKVAV) in vitro and induction of angiogenic behavior in vivo. J Cell Physiol. 153 (3), 614-625 (1992).
- Madri, J. A., Pratt, B. M., Tucker, A. M. Phenotypic modulation of endothelial cells by transforming growth factor-beta depends upon the composition and organization of the extracellular matrix. J Cell Biol. 106 (4), 1375-1384 (1988).
- Brooks, P. C., Montgomery, A. M., Cheresh, D. A. Use of the 10-day-old chick embryo model for studying angiogenesis. Methods Mol Biol. 129, 257-269 (1999).
- Yuan, K., et al. Activation of the Wnt/planar cell polarity pathway is required for pericyte recruitment during pulmonary angiogenesis. Am J Pathol. 185 (1), 69-84 (2015).
- Johns, A., Freay, A. D., Fraser, W., Korach, K. S., Rubanyi, G. M. Disruption of estrogen receptor gene prevents 17 beta estradiol-induced angiogenesis in transgenic mice. Endocrinology. 137 (10), 4511-4513 (1996).
- Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem Cells. 31 (2), 305-316 (2013).
- Richards, O. C., Raines, S. M., Attie, A. D. The role of blood vessels, endothelial cells, and vascular pericytes in insulin secretion and peripheral insulin action. Endocr Rev. 31 (3), 343-363 (2010).
- Ricard, N., et al. Increased pericyte coverage mediated by endothelial-derived fibroblast growth factor-2 and interleukin-6 is a source of smooth muscle-like cells in pulmonary hypertension. Circulation. 129 (15), 1586-1597 (2014).
- Buchwalow, I. B., Bocker, W. . Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 1-153 (2010).
- Tata, D. A., Anderson, B. J. A new method for the investigation of capillary structure. J Neurosci Methods. 113 (2), 199-206 (2002).
