Un modèle aigu rétinienne pour l'évaluation sanguin rétinien barrière Breach et potentiels médicaments pour le traitement
Summary
Un faible coût, système facile à utiliser et puissant est mis en place pour évaluer les traitements qui pourraient améliorer la violation du sang barrière rétinienne induite par l'histamine. navire de fuite de sang, l'activation des cellules Müller et la continuité des processus neuronaux sont utilisés pour évaluer la réponse aux dommages et son inversion avec un médicament potentiel, la lipoxine A4.
Abstract
A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An inflammatory factor, histamine, is demonstrated to compromise vessel integrity in the cultured retina through positive staining of IgG outside of the blood vessels. The effects of histamine itself and those of candidate drugs for potential treatments, such as lipoxin A4, are assessed using three parameters: blood vessel leakage via IgG immunostaining, activation of Müller cells via GFAP staining and change in neuronal dendrites through staining for MAP2. Furthermore, the layered organization of the retina allows a detailed analysis of the processes of Müller and ganglion cells, such as changes in width and continuity. While the data presented is with swine retinal culture, the system is applicable to multiple species. Thus, the model provides a reliable tool to investigate the early effects of compromised retinal vessel integrity on different cell types and also to evaluate potential drug candidates for treatment.
Introduction
Un nombre croissant de preuves soutient l'existence de la barrière de la rétine de sang (BRB) 1-5 et sa similitude avec la barrière hémato – encéphalique (BHE) 6,7. Compromission de la BHE a été étroitement liée causalement ou en tant que marqueur diagnostique pour les maladies neurodégénératives chroniques telles que la maladie d'Alzheimer (MA) et 8,9 aiguës des conditions telles que le délire 10. idées mécanistes dans ces pathologies et de découvertes pour les cibles potentielles de médicaments sont généralement entravés par l'accessibilité et réseau intrication limitée du cerveau. Des alternatives telles que l' imagerie in vivo 11, le cerveau organotypique culture 12, des cultures de cellules primaires 13,14 et des systèmes de co-culture 15 ont été générés. Cependant, la plupart de ces modèles nécessitent des instruments spéciaux, de longues périodes expérimentales ou plusieurs marqueurs pour identifier les cellules. similitudes structurelles et fonctionnelles entre BBB et BRB, ainsi qu'une corrélation entre l'dysfunctions des deux ont été soutenu 16-19. En outre, un accès plus facile, les types de cellules bien définies et une structure en couches ont permis à la rétine bien caractérisé comme une fenêtre dans le cerveau. Les identités structurales et fonctionnelles de la BHE et BRB restent à comparer en détail. Cependant, pathologies de la rétine, en particulier la violation BRB, ont également été étroitement associée à la progression de diverses maladies, y compris le diabète 18-19 et AD 21,22. Par conséquent, il est intéressant de mettre en place un système de dysfonctionnement BRB non seulement de délimiter le mécanisme, mais aussi pour cribler des médicaments potentiels. Dans ce rapport, un protocole permettant un dysfonctionnement BRB utilisant une culture rétinienne aiguë simple est élaboré et présenté.
Augmentation de la perméabilité BBB et des changements pathologiques AD-like ont été établis dans une culture du cerveau organotypique incubé avec de l' histamine, un médiateur pro-inflammatoire 12. Par conséquent, dans le système présenté, l'histamine a été applié à la culture ex vivo de la rétine à induire un dysfonctionnement BRB. Les rétines de plusieurs espèces, comme Mus musculus et Bos Taurus, ont été testés. En raison de leur disponibilité commerciale et de ressemblance avec les tissus humains, des globes oculaires du porc frais ont été utilisés pour fournir les données rapportées ici. Après incubation avec de l' histamine et / ou d' autres médicaments, les rétines ont été traitées pour l' évaluation par immunocoloration pour plusieurs protéines 12 telles que l' immunoglobuline G (IgG), l' un des principaux composants du sang; protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), un marqueur bien connu pour l'activation gliale; et la protéine associée aux microtubules 2 (MAP2), une protéine du cytosquelette spécifique des neurones essentiels pour l'assemblage des microtubules. En outre, la structure en couches de la rétine permet une analyse détaillée des processus de cellules de Müller et les cellules ganglionnaires, tels que des changements dans la largeur et la continuité. Ainsi plusieurs paramètres supplémentaires sont disponibles pour évaluer les conséquences de laviolation BRB à un stade précoce et d'évaluer les effets d'inversion des traitements potentiels.
Dans ce protocole, les effets d'inversion potentiels des médicaments dépistés sont évalués à partir de trois perspectives: la fuite des vaisseaux sanguins (BVS), l'activation des cellules gliales et les dommages-réponse des cellules neuronales. Plusieurs méthodes de quantification sont utilisées, par exemple, le niveau d'expression représentée par l'intensité de l'immunocoloration, mesure de la largeur d'un processus et la continuité des processus neuronaux représentés par un filtre d'amélioration. Pour mieux illustrer la méthode et pour aider à interpréter les résultats, lipoxine A4 (LXA4), un composé synthétisé de manière endogène en réponse à une lésion inflammatoire et atténuer la dysfonction endothéliale 23, a été choisie à des fins de démonstration.
Protocol
Representative Results
Discussion
In this report, we present a powerful ex vivo acute retinal model of BRB dysfunction using the swine retina. This model system does not require special instruments and can be easily adapted under most laboratory settings. However, to obtain a successful result, several steps require close attention. After obtaining the eyeballs from the source, they must be kept at 4 °C or on ice and processed as soon as possible. When the effect of a treatment is being analyzed, two halves of the same retina must be used -…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bringhurst Meats (Berlin, NJ) is acknowledged for their genuine help in providing the swine eyeballs.
Materials
| DMEM | Life Technologies | 11965-092 | |
| HBSS | Life Technologies | 14170-112 | |
| Sucrose | J.T.Baker | 4072-05 | |
| Histamine | Sigma | H7125-1G | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | ||
| PFA | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Freezing Media | Triangle Biomedical Sciences | TFM-5 | |
| Normal Goat Serum | Rockland | D104-00-0050 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| GFAP Antibody | Millipore | AB5804 | |
| MAP2 Antibody | EMD Millipore | MAB3418 | |
| FITC conjugated Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-095-152 | |
| Cy3 conjugated Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-165-150 | |
| mounting medium containing DAPI | Vector Laboratories, Inc. | H-1200 | |
| Laser Confocal Microscope | Nikon | Eclipse Ti microscope | |
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.45s |
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