Induktion Komplet Polyp Regeneration fra Aboral Physa af Starlet Sea Anemone<em> Nematostella vectensis</em

Summary

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Abstract

Cnidarianer, og specifikt Hydra, var de første dyr vist sig at regenerere beskadigede eller afhuggede strukturer, og faktisk sådanne undersøgelser velsagtens lanceret moderne biologisk undersøgelse gennem arbejdet i Trembley mere end 250 år siden. I øjeblikket studiet af regenerering har oplevet en opblomstring ved hjælp af begge de "klassiske" regenerative organismer, såsom Hydra, Planaria og Urodeles, samt en udvidelse spektrum af arter, der spænder over intervallet Metazoa, fra svampe gennem pattedyr. Udover dens iboende interesse som et biologisk fænomen, vil forstå, hvordan regenerering arbejder i en række arter informere os om, hvorvidt regenerative processer deler fælles træk og / eller arter eller kontekst-specifikke cellulære og molekylære mekanismer. Den starlet søanemone, Nematostella vectensis, er en ny model organisme til regenerering. Ligesom Hydra, Nematostella er medlem af den gamle phylum, Cnidaria, men inden for than klasse Anthozoa, en søster clade til hydrozoa der er evolutionært mere basal. Således aspekter af regenerering i Nematostella bliver interessant at sammenligne med de Hydra og andre cnidarianer. I denne artikel præsenterer vi en metode til at gennemskære, observere og klassificere regenerering af aboral ende af Nematostella voksen, som kaldes physa. Den physa undergår naturligt fission som et middel til ukønnet formering, og enten naturlig fission eller manuel amputation af physa udløser genvækst og reformation af komplekse morfologier. Her har vi kodificeret disse enkle morfologiske ændringer i en Nematostella Regeneration Iscenesættelse System (dettes NRSS-organ). Vi bruger dettes NRSS-organ til at afprøve virkningerne af chloroquin, en inhibitor af lysosomal funktion, der blokerer autofagi. Resultaterne viser, at regenerering af polyp strukturer, især mesenteries, er unormal, når autophagy inhiberes.

Introduction

Observation af regenerering i en enkelt hydra var den skelsættende begivenhed i fremkomsten af biologien som en eksperimentel videnskab ^1,2. Regeneration forbliver et fænomen af ​​ekstraordinært bred appel til biolog og lægge personen ens. Potentialet for udviklingsmæssige biologer, klinikere, biomedicinske forskere og væv ingeniører til at forstå og overvinde grænserne for menneskelig regenerering gør regenerering biologi mere end uløseligt interessant.

Nu, med brug af nye teknologier såsom genom sekventering og gevinst og tab af funktion værktøjer, er feltet klar til at drille hinanden regenerative mekanismer og i sidste ende at forstå, hvordan forskellige arter kan regenerere, mens andre ikke kan. Graden af ​​ensartethed i molekylære, cellulære og morfologiske reaktioner mangler at blive belyst, men indtil videre ser det ud til, at de grundlæggende reaktioner blandt dyr, der kan regenerere er mere ens, end det ville have været imagiNed kun et årti siden ^3.

Cnidarianer i særdeleshed er facile på regenerere næsten alle deres kropsdele midt et bredt spektrum af morfologisk mangfoldighed. Fra den ensomme ferskvand polyp, Hydra sammen med de små marine polypper, der bygger enorme koralrev, til de komplekse koloniale siphonophorer, såsom den portugisiske Man-O-War, regenerering er ofte en form for reproduktion, i tillæg til en mekanisme for reparere eller reformere beskadigede eller mistede kropsdele som følge af skade og prædation. Om de forskellige arter af Cnidaria anvender tilsvarende eller forskellige mekanismer til regenerering er et fundamentalt interessant spørgsmål ^4-6.

Vi, og andre har været at udvikle anthozoan, Nematostella vectensis som en model for regenerering ^7-17. Vi har for nylig udviklet en mellemstation system til at beskrive regenerering af et hele kroppen fra et morfologisk ensartet stykke væv gennemskæres fra Aboral ende af polyp ^10. Mens Nematostella polypper kan regenerere, når gennemskæres på ethvert niveau, valgte vi at skære voksne på en aboral position i den mest morfologisk simple region, physa, dels fordi det er tæt på det normale plan naturlig ukønnet fission ^18, og også fordi det tillader observation og molekylære analyser af, hvordan et hele kroppen samles igen fra de simpleste morfologiske komponenter.

Den Nematostella Regeneration Staging System (dettes NRSS-organ) tilvejebringer et relativt simpelt sæt af morfologiske kriterier, som kunne anvendes til at score forløbet af ethvert aspekt af regenerering af en amputeret physa under normale dyrkningsbetingelser eller eksperimentelt perturbed situationer som småmolekylære behandlinger, genetisk manipulation eller miljømæssig ændring. Som forventet, er dettes NRSS-organ bliver vedtaget som en morfologisk stillads, hvor de cellulære og molekylære begivenheder regenerering kan refereres10.

Endelig vores fremgangsmåde til skæring frembringer et gabende hul adskillige størrelsesordener større end utrolig lækker punktering anvendes i en nylig undersøgelse ^17, men begge sår heler i omkring 6 timer. Dokumentere de visuelt fængslende og adskilte faser af sårlukning bør foreslå eksperimentelle metoder til at forklare den tilsyneladende uafhængighed af størrelsen af ​​et sår, og den tid det tager at lukke. Således en dybere visuel forståelse af den aboral amputation proces, leveres af denne protokol, vil hjælpe yderligere undersøgelser i denne model regenerering systemet og udvide anvendelsen af denne iscenesættelse system ved hjælp af Nematostella vectensis.

Protocol

1. Konditionering af dyr for temperatur, Ernæring og Lys / Mørk Cycle Opnå Nematostella vectensis voksne fra en af de mange Nematostella laboratorier verden over, eller en non-profit leverandør (tabel 1) Vedligehold Nematostella ved konstant temperatur (typisk mellem 18 og 21 ° C) i mørke, i "1 / 3x" Kunstig Hav Vand (ASW) ved en saltholdighed på 12 promille (ppt). Opretholde kulturer i simple natronkalkglas dyrkningsskåle, typisk 250 ml …

Representative Results

Progressionen af morfologiske hændelser under regenerering i afhuggede physa er vist i figur 1A, som omfatter repræsentative visninger af physa på hvert dettes NRSS-organ fase. Den typiske physa cut site er angivet på voksne (pilespidser). Fotografierne i figur 1A viser progressiv regenerering af mundtlige og krop strukturer fra nyslået physa gennem fuldt dannet polyp. Figur 1B, C viser arrangementet af indre skillevægge, de mesent…

Discussion

Anvendelse af Nematostella som en model for sårheling og regenerering bliver stadig mere populære. Således er det vigtigt at være i stand til at visualisere de morfologiske mønstre af en særlig protokol, inden effektive cellulære og molekylære analyser kan tildeles og sammenlignes. Nematostella have en høj grad af regenerativ "fleksibilitet", at være i stand til at reformere næsten enhver manglende struktur amputeret på ethvert sted, på post-Planula stadier af livet. Således har…

Materials

Nematostella vectensis, adults	Marine Biological Lab (MBL)		non-profit supplier
Glass Culture Dish, 250 ml	Carolina Biological Supply	741004	250 ml
Glass Culture Dish, 1,500 ml	Carolina Biological Supply	741006	1,500 ml
Polyethylene transfer pipette, 5ml	USA Scientific	1022-2500	narrow bore, graduated
Polyethylene transfer pipet, tapered	Samco	202-205	cut off 1 inch of tip to make wide bore
Disposable Scalpel	Feather Safety Razor Co. Ltd	no. 10	blade should be curved
#5 Dumont Fine point tweezers	Roboz	RS5045	alternative suppliers available
Pyrex petri dish, 100 mm diameter	Corning	3160	can substitute other glass petri plates
Sterile 6 well plate	Corning Falcon	353046	or similar from other manufacturer
Sterile 12 well plate	Nunc	150628	or similar from other manufacturer
Sterile 24 well plate	Cellstar, Greiner bio-one	662-160	or similar from other manufacturer
Brine shrimp hathery kit	San Francisco Bay; drsfostersmith.com	CD-154005	option for growing brine shrimp
pyrex baking dish	common in grocery stores		option for growing brine shrimp
artificial seawater mix 50 gal or more	Instant Ocean; drsfoster-smith.com	CD-116528	others brands may suffice
Plastic tub for stock ASW preparation	various		common 25 gallon plastic trash can OK
Polypropylene Carboy	Carolina Biological Supply	716391	For working stock of ASW @ 12 ppt
Beaker, Graduated, 4,000ml	PhytoTechnology Laboratories	B199	For dilution of 36 ppt ASW to 12 ppt
Stereomicroscope and light source	various		with continuous 1 – 40x magnification