The recellularized extracellular matrix of a decellularized rat liver can be used as a humanized, three-dimensional ex vivo model to study the distribution and transgene expression of a virus or viral vector.
Denne protokol beskriver dannelsen af et tredimensionalt (3D) ex vivo lever model og dens anvendelse til undersøgelse og udvikling af virale vektorsystemer. Modellen opnås ved genbefolkning den ekstracellulære matrix af en decellulariseret rottelever med en human hepatocyt cellelinie. Modellen tillader studier i en vaskulariseret 3D celle-system, der erstatter potentielt skadelige eksperimenter med levende dyr. En anden fordel er den humaniserede karakter af modellen, der er tættere på human fysiologi end dyremodeller.
I denne undersøgelse udviser vi transduktionen af denne liver model med en viral vektor afledt af adenoassocierede vira (AAV vektor). Perfusionskredsløbet der leverer 3D leveren model med medier giver en nem måde at anvende vektoren. Systemet tillader overvågning af de store metaboliske parametre i leveren. For sidste ende kan tages vævsprøver at bestemme omfanget af recellularization af histologiske teknikker. Fordeling af virusvektoren og ekspression af det leverede transgen kan analyseres ved kvantitativ PCR (qPCR), Western blotting og immunhistokemi. Talrige anvendelser af vektoren modellen i grundforskning og i udviklingen af genterapeutiske anvendelser kan forudses, herunder udvikling af hidtil ukendte antivirale terapeutiske midler, Cancer Research, og studiet af virale vektorer og deres potentielle bivirkninger.
Most current biomedical research relies on one of two approaches, either two-dimensional (2D) cell culture experiments or animal models, which are three-dimensional (3D) by their very nature. However, these approaches have some severe drawbacks. Cells grown in 2D culture have been shown to differ in gene expression patterns and cell physiology from those cultivated under 3D conditions.1 Animal models, in addition to being associated with ethical concerns, often do not model human physiology well. Although the lack of obvious toxic effects of a compound must be confirmed in animal models prior to the first dosing in humans, multiple cases have been documented in which severe, sometimes fatal, adverse effects have occurred in clinical trials.2
To overcome these shortcomings, humanized 3D ex vivo organ models have become important research tools. When cultivated under suitable conditions, cells self-assemble into 3D structures known as spheroids. However, these spheroids lack a vascular system, which limits the distribution of small molecular compounds, large biologics and viral vectors alike. For example, adenoviral vectors only transduced the outer cell layers of spheroids prepared from human glioblastomas.3 A solution to this problem is the use of an organ model containing a vascular system. To this end, the organ of interest can be explanted from an animal, and the animal cells can be replaced by human cells. Various methods for decellularization of animal livers by treatment with detergents or sodium cholate have been described.4-6 The resulting extracellular matrix (ECM) harbors cytokines and growth factors which regulate various cellular processes.7 It can be used as a scaffold for recellularization with human cells to obtain a functional organ model.
In a recent study, we used a humanized 3D liver model to study distribution and transgene expression of an adeno-associated virus (AAV) vector.8 AAV vectors belong to the most promising viral vectors for gene therapeutic applications.9 The first, and to date only, approved gene therapeutic intervention in the Western world uses an AAV vector for the transfer of lipoprotein lipase.10
De rekonstituerede 3D lever her beskrevne giver en model til at studere virale vektorer i et humaniseret system. Repopulation af ECM af en rottelever med en human hepatocellulær carcinom-cellelinie frembringer et vaskulariseret, som muliggør studiet af store biologiske. Disse resultater giver et proof-of-concept, at den rekonstituerede leveren model kan effektivt transduceres med en viral vektor.
Til eksperimenterne vist her blev hver eneste Leverlappen transduceres af AAV vektor. Men i nogle indledende forsøg, enlige lapper blev ikke genbefolket med celler. Det er derfor vigtigt at forhindre cellerester eller andre komponenter fra okkludere det vaskulære system. For at teste, om alle lapper kan perfunderes, kan en ikke-toksisk farvestof, såsom phenolrødt skylles gennem leveren model.
En anden afgørende spørgsmål er at holde leveren stillads steril. Mens behandling med ethanol eller antibiotika er disadvantageous for det vaskulære system, bestråling af den ekstracellulære matrix med γ-stråling bevaret fartøjerne og steriliseres prøven.
Endvidere vil størrelsen af eksplanterede lever forskellige, således at antallet af celler til den recellularization proceduren og repopulation tid måske skal justeres for at opnå reproducerbare resultater.
De rottelevere anvendes i den foreliggende undersøgelse er forholdsvis store og kræver store mængder af celler og testreagenser (f.eks AAV vektorer). Desuden genoprettelse procedure tog mere end to uger. Dette begrænser antallet af replikater, der kan gøres med en rimelig indsats. Vi er i øjeblikket om modellen for muselevere, som kun tilnærmelsesvis en femtedel af volumenet af rottelevere, der tillader anvendelse af færre celler og mindre testreagenser. Selvom proportional skala-down af cellen nummer forekommer rimelig, de nøjagtige beløb skal fastsættes i furthendes eksperimenter.
En anden mangel ved den foreliggende model er brugen af den hepatocellulære HepG2-cellelinien. Eksperimenter i gang for at udvikle brugen af hepatocytter differentieret fra inducerede pluripotente stamceller, som vil give en fysiologisk mere relevant model. Endvidere leveren består af flere celletyper ud over de hepatocytter, fx, Kupffer-celler og sinosoids. Vi antager, at de forskellige celletyper vil genskabe deres naturlige miljøer, når en ECM er recellularized med flere celletyper.
3D liver model kombinerer flere fordele. En væsentlig ulempe ved konventionelle in vivo-modeller er, at animalske fysiologi adskiller sig væsentligt fra human fysiologi. Toksiske bivirkninger af behandlingen af en human patient kan derfor forblive uopdaget. Denne mangel kan overvindes ved rekonstituering af 3D liver model med humane celler, der bedre afspejler biologi humand patienter.
Den anden fordel af leveren modellen er dens bidrag til dyrevelfærd. Selvom dyr komponenter er nødvendige til rekonstituering eksperimenter, tilgangen følger stadig formålene med 3R-princippet (erstatning, begrænsning, forfining), som kan anvendes overskydende dyr, der blev aflivet for andre dyreforsøg, dvs., ikke er behov for yderligere dyr og tilgangen helt undgår lidelse for dyrene, som ofte er forbundet med in vivo forsøg. Sfæroider er et alternativt værktøj til at studere cellulære processer i et 3D-system. Imidlertid er sfæroider ikke vaskulariseret, så store stoffer og biologiske ikke trænge dybt ind i de indre dele af strukturen. Disse problemer er blevet løst med den vaskulariserede 3D leveren model.
I eksperimenterne beskrevet her, blev AAV-vektorer undersøgt, da de er blandt de mest lovende kandidater til genterapeutiskanvendelser. Så talrige genterapeutiske fremgangsmåder sigte på målretning leveren, fx til behandling af infektioner med hepatitis virus eller af alfa-1-antitrypsin-mangel, kan 3D leveren anvendes i fremgangsmåden ifølge disse AAV-vektor udvikling. Det er naturligvis også egnet til undersøgelse af andre hepatotrope virale vektorer, f.eks, adenovirusvektorer. Desuden kan den anvendes til at studere infektiøse hepatitisvirus, såsom hepatitis B eller C virus. Det kan for eksempel anvendes til at designe nye antivirale strategier. Desuden 3D orgel-modeller repræsenterer lovende værktøjer til at udvikle nye cytostatiske lægemidler til behandling af kræft og at gennemføre toksikologiske undersøgelser. På lang sigt kan kunstige levere anvendes i regenerativ medicin som transplantationer. Tilsammen 3D leveren model tilbyder en bred vifte af applikationer i infektion biologi og andre områder af biomedicinsk forskning.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Bernd Krostitz for technical assistance, Radoslaw Kedzierski for initial contributions to the project, Erik Wade for proofreading and giving helpful comments, and Prof. Heike Walles for providing the bioreactor and sharing her valuable experience with organ decellularization. We are also thankful for funding of the project and publication by the Berlin University of Technology.
Incubator | Fraunhofer | / | |
Peristaltic Pump | Fraunhofer | / | |
Flange with groove | Duran | 2439454 | modified by gaffer |
O-Ring Transparent | Duran | 2922551 | |
Quick Release Clamp | Duran | 2907151 | |
Flat Flange Lid | Duran | 2429857 | modified by gaffer |
Screw thread Tube | Duran | 2483802 | modified by gaffer |
Screw thread Tube | Duran | 2483602 | modified by gaffer |
Silicone sealing Ring | Duran | 2862012 | |
Screw Cap | Duran | 2924013 | |
Screw Cap | Duran | 2924008 | |
Screw Cap with aperture | Duran | 2922709 | |
Screw Cap with aperture | Duran | 2922705 | |
Filter | Sarstedt | 831,826,001 | |
Silicone Tubing | VWR | 228-1500 | |
Tube connector | Ismatec | ISM556A | |
Biocompatible Tubing | Ismatec | SC0736 | |
T175 culture flasks | Greiner bio-one | 660 160 | |
RPMI 1640 | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0501-500 | |
glutamine | BioWest SAS (Th. Geyer) | X0551-100 | |
Trypsin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0940-100 | |
penicillin/ streptomycin | BioWest SAS (Th. Geyer) | L0022-100 | |
fetal calf serum | cc pro | S-10-M | |
Tissue-Tek O.C.T. | Weckert-Labortechnik | 600001 | |
HepG2 | DSMZ | ACC 180 | |
Cryomold 15x15x5mm | Sakura | 4566 | |
Biopsy punch 4mm | pfm medical | 48401 | |
Nucleospin miRNA | Macherey & Nagel | 740971.10 | |
Nucleospin RNA/DNA Buffer Set | Macherey & Nagel | 740944 |