forberedelse og<em> I Vivo</em> Bruk av en aktivitetsbasert Probe for<em> N</em> -acylethanolamine Acid amidase
Summary
Her beskriver vi fremstilling og anvendelse av en aktivitetsbasert sonde (ARN14686, undek-10-ynyl- N – [(3 S) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat) som gjør det mulig for påvisning og kvantifisering av aktive form av proinflammatoriske enzymet N -acylethanolamine syre amidase (naaa), både in vitro og ex vivo.
Abstract
Aktivitetsbaserte protein profilering (ABPP) er en fremgangsmåte for identifikasjon av et enzym av interesse i en kompleks proteom- ved bruk av en kjemisk sonde som er rettet mot enzymets aktive seter. En reporter kode innføres i sonden gjør det mulig for påvisning av den merkede enzym ved in-gel fluorescens skanning, protein-blot, fluorescens mikroskopi, eller væskekromatografi-massespektrometri. Her beskriver vi utarbeidelse og bruk av det sammensatte ARN14686, et klikk kjemi aktivitetsbaserte probe (CC-ABP) som selektivt gjenkjenner enzymet N -acylethanolamine syre amidase (naaa). Naaa er en cystein hydrolase som fremmer betennelse ved å deaktivere endogene peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor (PPAR) alfa agonister som palmitoylethanolamide (PEA) og oleoylethanolamide (OEA). Naaa blir syntetisert som et inaktivt proenzym full-lengde, som aktiveres ved autoproteolysis i det sure pH-verdien i lysosomet. Lokaliserings studier have vist at naaa uttrykkes hovedsakelig i makrofager og andre monocytt-avledede celler, så vel som i B-lymfocytter. Vi gir eksempler på hvordan ARN14686 kan brukes til å oppdage og kvantifisere aktiv naaa ex vivo i gnager vev av protein blot og fluorescens mikroskopi.
Introduction
Vanligvis brukes fremgangsmåter for å undersøke uttrykk mønstre, interaksjoner og funksjoner av proteiner, inkludert væskekromatografi-massespektrometri plattformer for hagle analyse 1,2, gjær to-hybrid metoder 3,4, og in vitro-analyser, er begrenset ved at de er ute av stand til å vurdere aktiviteten av proteiner i sin opprinnelige tilstand. Aktivitetsbaserte protein profilering (ABPP) kan brukes til å fylle dette gapet. I denne tilnærmingen sonder små-molekyl er i stand til kovalent binding til det aktive sete av et enzym av interesse er konjugert til en rapportørgruppe som gir mulighet for påvisning av mål. Ved hjelp av klikk kjemi (CC), kan reporteren være integrert inn i sonden eller kan innføres etter mål inngrep har funnet sted 5,6. Den sistnevnte metode krever bruk av prober som inneholder passende kjemiske grupper, for eksempel en terminal alkyn eller azid, som kan modifiseres med en rekke rapportør reagenser via bio-ortogonale reaksjoner such som Cu (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cykloaddisjon 7-9 eller Staudinger ligering 10,11.
Nylig har vi beskrevet forbindelsen ARN14686 som den første ABP for in vitro og in vivo deteksjon av cystein hydrolase, naaa 12. Naaa katalyserer den hydrolytiske deaktivering av mettede og monoumettede Fåes, inkludert oleoylethanolamide (OEA) og palmitoylethanolamide (PEA), som er endogene agonister for den anti-inflammatoriske nukleær reseptor PPAR-alfa 13-15. Naaa uttrykkes hovedsakelig i makrofager og andre monocytt-avledede celler, så vel som i B-lymfocytter 14,16, hvilket antyder en rolle i reguleringen av den medfødte immunrespons. Enzymet blir syntetisert i den grove endoplasmatiske retikulum i en inaktiv form, og aktiveres i sure i cellen ved hjelp av en mekanisme 17 autoproteolytisk. Autoproteolytisk cleavage genererer en ny N-terminale cystein (C131 i mus og rotter, NOK 126 hos mennesker), er at nukleofilen er ansvarlig for hydrolyse FAE 18,19. Farmakologisk hemming av naaa aktivitet endrer FAE syntese / nedbryting av balansen i favør av økt cellulære nivåer av Faes 16,20,21. Flere β-lakton og β-laktam-derivater er blitt vist å hemme aktiviteten naaa med høy potens og selektivitet 16,22-26. Disse inhibitorene virker gjennom S -acylation av den katalytiske cystein 16,27,28.
Forbindelsen ARN14686 ble designet basert på den kjemiske strukturen til systemisk aktiv, serin-avledede β-laktam naaa inhibitor, ARN726 (4-cyclohexylbutyl- N – [(S) -2-oksoazetidin-3-yl] karbamat) 16. 4-butyl-cykloheksyl gruppe av ARN726 ble erstattet med en C9 mettet alifatisk kjede som bærer en terminal alkyn kode for etterfølgende CC konjugering med et azid bærende reporter tag. Vi valgte å lage en to-trinns ABP å minimally endre strukturen av den opprinnelige stillaset, og dermed opprettholde affiniteten av sonden for naaa. Dessuten unngår innføring av voluminøse koder, kunne en slik sonde være mer egnet for in vivo-behandling enn en direkte ABP. ARN14686 hemmer naaa med høy potens (hNAAA IC50 = 6 nM, rNAAA IC 50 = 13 nM) ved å danne en kovalent addukt med den katalytiske cystein av enzymet 12. Eksperimenter i levende rotter viste at proben er selektivt i å fange naaa uttrykt i lungene. Acid ceramidase, en annen cystein amidase som deler 33-34% identitet med naaa, ble også identifisert som et lav-affinitet mål ved bruk av høy-probe-konsentrasjoner (10 uM in vitro, 10 mg / ml intravenøs, IV) 12. Vi har også anvendt ARN14686 for å studere nærværet av aktiv naaa i betent vev fra rotte etter administrering av Freunds fullstendige adjuvans (CFA) 29.
Her skisserer vi en protokoll for preparatipå av ARN14686 (figur 1) og dens anvendelse i etterforskningen av naaa aktivering ex vivo. Som et eksempel, beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å visualisere naaa i rotte potene etter CFA administrering. I dette eksperimentet blir proteinene ekstrahert fra labb vev etter intravenøs injeksjon av sonden, og ABP-merkede proteom- blir underkastet CC med biotin-azid. Biotinylerte prøver er anriket ved hjelp av streptavidin perler, og proteinblottene blir utført. I et annet program, beskriver vi lokalisering av aktive naaa ved fluorescens mikroskopi i muse lungene fra probe-behandlede mus. I dette tilfellet er vevet i snitt og deler er underkastet CC for rhodamin tilsetning. En arbeidsflyt ordningen er illustrert i figur 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enzymaktivitet er fint regulert på forskjellige nivåer, inkludert RNA-transkripsjon, proteinsyntese, proteintranslokasjon, post-translasjonell modifikasjon, og protein-protein-interaksjon. Ofte enzymet uttrykk alene ikke høyde for sin aktivitet. ABPP ble utviklet for å studere aktiviteten av proteiner i sin opprinnelige tilstand. To funksjonene er nødvendig: en kjemisk sonde som kovalent binder seg til det aktive sete av et enzym av interesse, og en reporter-tag for å detektere sonde-merket enzym.
<p class="jo…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).
Materials
| 1,1’-sulfonyldiimidazole | Sigma Aldrich | 367818 | Harmful |
| 2-dipyridylcarbonate | Fluorochem | 11331 | Harmful |
| 2-Methylbutan | Sigma Aldrich | M32631 | Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment |
| 4-(Dimethylamino)pyridine | Sigma Aldrich | 107700 | Toxic |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 695092 | Flammable, Corrosive |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Flammable, Toxic |
| Activated charcoal | Sigma Aldrich | 161551 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A9434 | Harmful |
| Azide-PEG3-Biotin | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| BCA protein assay kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bio-spin columns | Biorad | 732-6204 | |
| Biotin | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Blocking buffer | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| b-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | Higly toxic |
| Bovin serum albumine (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Bromophenol blue | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Health hazard |
| Ceric ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 22249 | Oxidizing, Harmful |
| Chloral hydrate | Sigma Aldrich | C8383 | Higly toxic |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Toxic |
| Cyclohexadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Flammable, Health hazard |
| Cyclohexane | Sigma Aldrich | 34855 | Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 34856 | Harmful, Health hazard |
| Diethyl ether | Sigma Aldrich | 296082 | Flammable, Harmful |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 2860 | Flammable, Harmful |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 34858 | Flammable, Harmful |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34966 | Highly toxic |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Flammable, Toxic, Health hazard |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E7750 | Harmful, Corrosive |
| N,N-diisopropylethylamine | Sigma Aldrich | D125806 | Flammable, Corrosive, Toxic |
| N,N-dimethylformamide | Sigma Aldrich | 227056 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| N-Cbz-L-Serine | Fluorochem | M03053 | Harmful |
| Nikon A1 confocal microscopy | Nikon | Read the user manual | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladium on carbon | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidine | Sigma Aldrich | A88255 | Toxic, Health hazard, Environmental hazard |
| Paraformaldehyde | sigma Aldrich | 441244 | Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable |
| Poly(ethylene glycol) | Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold antifade mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Avoid bubbles formation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | Toxic, corrosive, falmmable |
| Sodium hydride | Sigma Aldrich | 452912 | Flammable |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 immage scanner | FUJIFILM | Read the user manual | |
| Streptavidin agarose | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanol | Sigma Aldrich | 360538 | Toxic, flammable |
| Tetrahydrofuran | Sigma Aldrich | 186562 | Flammable, Harmful, Health hazard |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizer | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Harmful |
| Urea | Sigma Aldrich | U5378 | Toxic, warm at 50 °C to dissolve |
References
- Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
- Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
- Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
- Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
- Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
- Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
- Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective “ligation” of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
- Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
- Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
- Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
- Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
- Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
- Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
- Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
- Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
- Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
- Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
- Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
- West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
- Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
- Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
- Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
- Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
- Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
- Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
- Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
- Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
- Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
- Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund’s Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
- Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
- Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
- Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
- Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).
