Questo rapporto descrive protocolli per caratterizzare le interazioni tra proteine della membrana esterna batterica e la vitronectina regolatore complemento umano. I protocolli possono essere utilizzati per studiare le reazioni di associazione e la funzione biologica di vitronectin in qualsiasi specie batteriche.
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Articolo metodologico
Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero
In questo articolo
Sommario
Abstract
I batteri utilizzare regolatori di complemento come mezzo per eludere la risposta immunitaria. Qui, descriviamo protocolli per valutare l'acquisizione di vitronectin ruolo presso i giochi di superficie delle cellule batteriche nella resistenza al sistema immunitario dell'ospite. Esperimenti di citometria a flusso identificato vitronectina plasmatica umana come un legante per la proteina della membrana esterna batterica del recettore H di Hemophilus influenzae tipo f. Un'analisi enzima-collegata dell'immunosorbente è stata impiegata per caratterizzare le interazioni proteina-proteina tra proteina ricombinante purificata H e vitronectina e affinità di legame è stata valutata mediante interferometria bio-strato. L'importanza biologica del legame di vitronectin alla proteina H alla superficie delle cellule batteriche di evasione della risposta immunitaria ospite è stata confermata usando un'analisi di resistenza di siero con siero umano normale e vitronectina-vuotati. L'importanza di vitronectin in aderenza batterica è stata analizzata utilizzando lastre di vetro con e senza rivestimento vitronectina, seguita dalla macchiatura di grammo. Infine, è stata studiata l'adesione batterica di monostrati di cellule epiteliali alveolari umane. I protocolli descritti qui possono essere facilmente adattati per lo studio di qualsiasi specie batteriche di interesse.
Introduzione
Vitronectina (Vn) è una glicoproteina umana importante coinvolti nel mantenimento dell'omeostasi via il regolamento del sistema fibrinolitico. VN funziona anche come un regolatore di complemento inibendo la via di complemento terminale durante la formazione del complesso C5b6-7 e polimerizzazione C9. Parecchi agenti patogeni batterici sono stati indicati per reclutare Vn alla superficie delle cellule come mezzo di resistenza complemento deposizione1,2,3. Inoltre, Vn funziona come una molecola di "sandwich" tra batteri e recettori delle cellule epiteliali di host, quindi promu....
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Protocollo
1. analisi di Vn come ligando della proteina della superficie batterica
-
Rilevamento di Vn-associazione sulla superficie batterica mediante citometria a flusso
Nota: In citometria a flusso, abbiamo usato side scatter e forward scatter a cancello eventi positivi. Per esaminare le interazioni con Vn, gli isolati clinici di Hif (n = 10)7 sono stati selezionati insieme a e. coli BL21 (DE3) come controllo negativo (Figura 1A).- Hif cultura clinica isola nel mezzo di infusione (BHI) cervello-cuore completato con 10 µ g/mL NAD ed Emina a 37 ° C con agitazione ....
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Risultati
VN-si legano alla superficie dei batteri è stato determinato tramite flusso cytometry. Tutti Hif isolati clinici testati in questo studio ha reclutato Vn alla superficie delle cellule. Alcuna interazione di Vn con superficie delle cellule è stata osservata per il ceppo di controllo negativo Escherichia coli (Figura 1A). Come illustrato nella Figura 1B, PH è una proteina legante il Vn pri.......
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Discussione
Batteri patogeni reclutano Vn alla superficie delle cellule e utilizzano questo regolatore di complemento per impedire la deposizione di fattori del complemento e completamento del complesso membrana attacco2. VN funziona anche come una molecola di ponte tra proteine di superficie batteriche e host recettori di superficie, consentendo in tal modo gli agenti patogeni di aderire alla superficie delle cellule epiteliali e successivamente mediare interiorizzazione. In questo studio, descriviamo i prot.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da borse di studio dalla Fondazione di Anna ed Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. e fondamento di Edla Johansson, svedese Medical Research Council (concedere numero K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondazione di cancro all'Università Ospedale a Malmö, della società fisiografica (di Forssman Foundation) e del Consiglio della Contea di Skåne Fondazione ricerca e sviluppo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,5 mL thermomixter | Eppendorf | 5355 | secco riscaldamento e raffreddamento shaker |
| 5 mL tubo in polistirene a fondo tondo | BD Falcon | 60819-138 | 12 × 75 mm stile |
| 5% CO2 fornito incubatore | Thermo Scientific | ||
| provetta a fondo tondo in polistirene da 6 mL | VWR | 89000-478 | 12 × 75 mm con tappo |
| piastre a 24 pozzetti | BD Falcon | 08-772-1H | Grado di coltura cellulare |
| 30% Perossido di idrogeno (H2O2) | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | Grado per analisi di laboratorio |
| 75 cm2 pallone per coltura tissutale | BD Falcon | BD353136 | Vented |
| Piastra a fondo piatto nera a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | 655090 | Coltura tissutale trattata & micro; Piastre nere trasparenti |
| A549 Linea cellulare umana | Sigma-Aldrich | 86012804-1VL | |
| Enzima di distacco cellulare (Accutasi) | grado per coltura cellulare | Sigma-Aldrich | A6964-500ML |
| Pall Life Science | 18-5095 | Sensore per proteina immobilizzata mediante accoppiamento amminico | |
| Acetone | VWR | 97064-786 | |
| Albumine di siero bovino di grado di analisi (BSA) | Sigma-Aldrich | A2058 | Adatto per colture cellulari |
| Carta bibulosa | VWR | 28511-007 | |
| Interferometro a biostrato | Pall Life Science | FB-50258 | Apparecchiatura di misurazione dell'interferometria a doppio strato |
| Soluzione cristallovioletto | Sigma-Aldrich | HT90132-1L | |
| C4BP (proteina legante C4b) | Complement Technology, Inc. | A109 | Acquistato come Congelato in forma liquida |
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5670-500G | |
| Soluzione di carbol-fucsina | Sigma-Aldrich | HT8018-250ML | |
| Acido citrico | Sigma-Aldrich | 251275-500G | American Chemical Society (ACS) grado |
| decolorante | Sigma-Aldrich | 75482-250ML-F | |
| E. coli ospite (E. coli BL21) | Novagen | 69450-3 | Ospite di espressione proteica |
| F12 medio | Sigma-Aldrich | D6421 | Citometro a flusso per colture cellulari |
| BD Biosciences | 651154 | Grado di analisi cellulare per applicazioni di ricerca | |
| Siero fetale di vitello (FCS) | Sigma-Aldrich | 12003C | Adatto per colture cellulari |
| Siero umano normale (NHS) | Complement Technology, Inc. | NHS | Pooled siero umano |
| coniugato con FITC anticorpi anti-pecora dell'asino | AbD Serotec | STAR88F | Gentamicina policlonale |
| Sigma-Aldrich | G1397 | Grado di coltura cellulare | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G9391 | Adatto per colture cellulari |
| Emocitometro | Marienfeld | 640210 | |
| Anticorpi anti-His tag coniugati HRP | Abcam | ab1269 | Fattore umano policlonale |
| H | Complement Technology, Inc. | A137 | Acquistato come liquido congelato da |
| C4BP | Complement Technology, Inc. | A109 | Soluzione congelata |
| Albumina sierica umana | Sigma-Aldrich | A1653-10G | polvere liofilizzata |
| Istidina colonna in resina di affinità (HisTrap HP) | GE Health Care Life Science | 17-5247-01 | Colonne preimpaccate con Ni Sepharose |
| PH marcato | in modo ricombinante espresso e purificato nel nostro laboratorio | ||
| Soluzione di iodio | Sigma-Aldrich | HT902-8FOZ | |
| Metanolo | VWR | BDH1135-1LP | Grado di analisi |
| Microscopio | Olympus | IX73 | Microscopio invertito |
| Vetrini per microscopio | Sigma-Aldrich | S8902 | liscio, dimensioni 25 mm &volte; 75 mm |
| Cloruro di magnesio (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-1KG | |
| Plasmide contenente C terminale 6x His-tag sulla spina dorsale (pET26(b)) | Novagen | 69862-3 | Vettore di DNA |
| Piastre per microtitolazione in polisorbo | Sigma-Aldrich | M9410 | per idrossido di potassio ELISA |
| (KOH) | Sigma-Aldrich | 6009 | American Chemical Society (ACS) grado |
| Pecora anticorpi Vn | AbD Serotec | AHP396 | policlonale |
| Stuart Scientific | STR6 | Agitatore a piattaforma | |
| Pallone per colture tissutali | BD Falcon | 3175167 | 75 cm2 |
| Termomiscelatore | Sigma-Aldrich | T3317 | Agitatore di riscaldamento e raffreddamento a blocco secco |
| Tetrametilbenzidina | Sigma-Aldrich | 860336-100MG | |
| Vitronectina (Vn) | Sigma-Aldrich | V8379-50UG | grado di coltura cellulare |
Riferimenti
- Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
- Hallstrom, T., et al.
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Ristampe e permessi
