כאן, אנו מציגים מתודולוגיה ליצירה וניהול של מיקרוספירות פולי (חומצה לקטית-קו-גליקולית) (PLGA) טעונות עניין לאיי עכבר שלמים בתרבית עם ניתוח אימונופלואורסצנטי לאחר מכן של התפשטות β תאים. שיטה זו מתאימה לקביעת היעילות של מיטוגנים β תאים מועמדים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיתוח חומרים ביולוגיים גדל באופן משמעותי את פוטנציאל שיגור תרופות למגוון של סוגי תאים ורקמות, כולל β-תאי הלבלב. בנוסף, חלקיקים ביולוגיים, הידרוג, ופיגומים גם מספקים הזדמנות ייחודית לניהול מתמשך, משלוח סמים לשליטה על בטא תאים בתרבית ו במודלי רקמה מושתלות. טכנולוגיות אלו מאפשרות בחקר גורמי התפשטות β-cell המועמד באמצעות איי שלמים ומערכת רלוונטית translationally. יתר על כן, בקביעה האפקטיבית ואת הכדאיות של גורמי מועמד בהמרצת ההתרבות β-cell במערכת תרבות היא קריטית לפני לנוע קדימה מודלי in vivo. בזאת, אנו מתארים שיטת שיתוף תרבות איי עכבר שלמים עם מתחם מתכלה של עניין (COI) פולי -loaded (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) (PLGA) microspheres לצורך הערכת ההשפעות של שנגרם o שחרור באתרוגורמים mitogenic f על התפשטות β-cell. טכניקה זו מתארת בפירוט כיצד ליצור microspheres PLGA המכיל מטען רצוי באמצעות ריאגנטים זמינים מסחרי. בעוד הטכניקה המתוארת משתמשת גורם הגדילה רקמת החיבור אנושי רקומביננטי (rhCTGF) כדוגמה, מגוון רחב של COI יכול לשמש בקלות. בנוסף, שיטה זו מנצלת 96-גם צלחות כדי למזער את כמות ריאגנטים צורך להעריך התפשטות β-cell. פרוטוקול זה ניתן להתאים בקלות כדי להשתמש בביו-חומרים אלטרנטיביים אופייני תא אנדוקריניות אחרות כגון הישרדות תא ומצב בידול.
מבוא
β-תאי לבלב הם התאים היחידים המייצר אינסולין בגוף הם קריטיים לשמור על הומאוסטזיס הגלוקוז בדם. בעוד אנשים בריאים הם בעלי מסת β-cell מספיק ולתפקד להסדיר דם גלוקוז כראוי, אנשים עם סוכרת מתאפיינים המוני β-cell מספיק ו / או פונקציה 1,2. הוצע כי גרימת התפשטות β-cell יכול בסופו של דבר להגדיל β-cell המוני ולשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בחולי סוכרת 3. עם זאת, הערכה ואימות של תרכובות שגשוג פוטנציאל β-תא איי שלמים הכרחי לפני ניתן לפתח טיפולים יעילים. השתלת איי אדם cadaveric לתוך אנשים עם סוכרת משחזר הומאוסטזיס הגלוקוז בדם במשך זמן מה, אבל זמינויות ההצלחה של הליך ניסיוני זה הפריעו מחסור איי אדם זמינים להשתלה ועל ידי מוות בט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים אושרו ובוצעו בהתאם הטיפול בבעלי החיים המוסדי ונדרבילט ועדת השימוש.
1. תיוג COI עם Fluorophore (אופציונלי)
- בחר צבע פלואורסצנטי כי יגיב עם אמין ראשוני חינם (למשל, על חלבון), כגון אסטרים succinimidyl או נגזר והעמסה, לדמיין מטען microsphere. ממיסים עודף 8x טוחנת (יחסית שומות של COI) של fluorophore לתוך 200 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO).
- Resuspend 50 מ"ג של COI עד לנפח סופי של 800 μl בתמיסת רכב (ריכוז סופי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 הוא ייצוג חזותי של microspheres שנוצר באמצעות פרוטוקול לעיל. הפרוטוקול המתואר כאן תשואות microspheres הטעון rhCTGF בגדלים שונים. השבר הגדול של microspheres יהיה בין 1 ל -10 מיקרומטר קוטר, אם כי microspheres מסוים עשוי להיות גדול יותר (איור 2). אם ירצה, גודל microsphere יכול להיות מכוון אופטימיזציה על בסיס פרמטרי ייצור כגון מהירות המגון וזמן, ריכוז פעיל שטח בשימוש, ואמצעי אחסון יחסי של כל שלב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
המחקר של התפשטות β-cell בתרבות נפגע בדרך כלל על ידי מספר קשיים. ראשית, קווי β-cell הנציח מאופיינים לתארים גבוהים של התפשטות ממה נמצא β-תאי אנדוגני איים חי. בנוסף, שורות התאים הנציחו אלה חסרות את הארכיטקטורה הנורמלית חיונית לתפקוד β-תא נורמלי. שתי עובדות אלו מקשות על מנת לקבוע אם תוצאות שהתקבלו באמצעות קווי β-cell הנציחו יקיימו נכון כאשר נבדקו in vivo או איים שלמים. הפרוטוקול המתואר שלנו, אשר משתמש איי עכבר שלמים טרי מבודדים, עוקף בעיות אלה כמו ארכיטקטורת איון מתוחזק התפשט.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות לבת'אני קרבונואו (אוניברסיטת ונדרבילט) על הקריאה הביקורתית של כתב היד הזה. אנו מודים גם לאנסטסיה קולדרן (המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט) על בידוד האיים, ולד"ר אלווין סי פאוורס (המרכז הרפואי של אוניברסיטת ונדרבילט) ולד"ר דיוויד ג'ייקובסון (אוניברסיטת ונדרבילט) על השימוש במתקן הצנטריפוגות ותרביות הרקמות שלהם. מחקר זה כלל שימוש בליבת הרכש והניתוח של האי של מרכז המחקר וההדרכה לסוכרת ונדרבילט הנתמך על ידי DK20593 מענקים של NIH. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (14POST20380262) ל-R.C.P., ומענקים מהקרן לחקר סוכרת נעורים (1-2011-592), והמחלקה לענייני חיילים משוחררים (1BX00090-01A1) ל-MAG.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אורגון ירוק 488 חומצה קרבוקסילית, Succinimidyl Ester, 6 איזומרים | ThermoFisher Scientific | O6149 | לתיוג COI עם פלואורופור |
| DMSO דימתיל סולפוקסיד | פישר BioReagents | BP231-1 | להמסת פלואורופור בשלב 1 |
| עמודי התפלה חד פעמיים PD-10 | Healthcare | 17-0851-01 | עמוד התפלה בשימוש בשלב 1 |
| רסומר RG 505, פולי (D,L-לקטיד-קו-גליקוליד), אסתר מסתיים, משקל מולקולרי 54,000 - 69,000 | סיגמא-אולדריץ' | 739960 | משמש ביצירת מיקרוספירות בשלב 2 |
| פולי (ויניל אלכוהול) משקל מולקולרי 89,000 - 98,000 | סיגמא-אולדריץ' | 341584 | משמש ביצירת מיקרוספירות בשלב 2 |
| RPMI 1640 | Thermo Scientific | 11879-020 | לטיפוח איים |
| דקסטרוז נטול מים | Fisher BioReagents | 200-075-1 | תוסף לתקשורת איים |
| פניצילין-סטרפטומיצין | סיגמא-אולדריץ' | P4333 | אנטיביוטיקה לתקשורת איים |
| סרום סוס רגיל | Jackson ImmunoResearch | 008-000-121 | תוסף לתקשורת איים |
| 96 בארות צלחת תרבית רקמות | קורנינג | 3603 | לתרבות איים |
| אתילן גליקו-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית | סיגמא-אולדריץ' | E4378 | תוסף לתקשורת אי טרום בדיקה |
| ציטוספין 4 ציטוצנטריפוגה | תרמו מדעית | A78300003 | לספינינג תאים על שקופיות מיקרוסקופ |
| EZ Single Cytofunnel | Thermo Scientific | A78710020 | לספינינג תאים על שקופיות |
| מיקרוסקופEthylenediaminetetraacetic חומצה | פישר BioReagents | BP118-500 | משמש בפירוק איים |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | לקיבוע תאים |
| Triton X-100 | פישר ביו-ריאגנטים | BP151 | לתאים חודרים |
| סרום חמור רגיל | ג'קסון ImmunoResearch | 017-000-121 | ריאגנטים חוסמים לאימונופלואורסצנציה |
| נוגדן אנטי-Ki67 | abcam | ab15580 | עבור Ki67 אימונופלואורסצנציה |
| חזיר ניסיונות פוליקלונלי אנטי אינסולין | Dako | A0564 | לאימונופלואורסצנציה אינסולין |
| Cy3 AffiniPure חמור נגד ארנב | ג'קסון ImmunoResearch | 711-165-152 | עבור Ki67 אימונופלואורסצנטי |
| Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | עבור אינסולין אימונופלואורסצנטי |
| DAPI (4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול, דיהידרוכלוריד)ThermoFisher | Scientific | D1306 | להדמיית גרעינים באימונופלואורסצנציה |
| Aqua-Mount | Lerner Laboratories | 13800 | מדיית הרכבה לייבוש מהיר |
| FreeZone -105 ° C 4.5 ליטר אשד ספסל הקפאה מערכת יבשה | Labconco | 7382020 | לליופיליזציה של מיקרוספירות |
מקורות
- Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
- Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
