טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

סיכום

אנו מציגים פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של ביציות דרוזופילה בוגרות. שיטות אלו מאפשרות הדמיה של התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר ותפקודו במהלך מיוזה.

תקציר

הפרדת כרומוזומים בביציות אנושיות מועדת לטעויות, וכתוצאה מכך אנופלואידיה, שהיא הגורם הגנטי המוביל להפלה ולמומים מולדים. חקר התנהגות הכרומוזומים בביציות מאורגניזמים מודל טומן בחובו הבטחה רבה לחשוף את הבסיס המולקולרי של הרגישות של ביציות אנושיות לאנופלואידיה. Drosophila melanogaster נתון למניפולציה גנטית, עם למעלה מ-100 שנות מחקר, קהילה ופיתוח טכניקות. עם זאת, להמחשת התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר בביציות דרוזופילה יש אתגרים מיוחדים, בעיקר בשל נוכחותם של ממברנות המקיפות את הביצית שאינן חדירות לנוגדנים. אנו מתארים כאן פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של הרכבת ציר מיוזה I והתנהגות כרומוזומים בביציות דרוזופילה, המאפשרים דיסקציה מולקולרית של הפרדת כרומוזומים באורגניזם מודל חשוב זה.

מבוא

חקר המיוזה מתואר לפעמים כ"גנטיקה של הגנטיקה". הסיבה לכך היא שהתכונות הבסיסיות של תורשת כרומוזומים ומבחר עצמאי מתבצעות באמצעות הפרדת כרומוזומים במהלך ייצור הגמטות. הדגמה חשובה של תאוריית הכרומוזומים של התורשה הגיעה ב-1916 מעבודתו של קלווין ברידג'ס ב-Drosophila melanogaster¹. מחקר זה ומחקרים גנטיים קלאסיים אחרים בדרוזופילה תרמו רבות להבנת הגנטיקה שלנו. בדיקה ציטולוגית של כרומוזומים מיוטיים בביציות דרוזופילה, לעומת זאת, הייתה מאתגרת. הסיבה העיקרית לכך היא שאימונופלואורסצנציה של ביציות דרוזופילה בשלב מאוחר, כאשר הציר מתאסף והכרומוזומים מכוונים להפרדה, נפגעת על ידי נוכחות של ממברנות שהופכות את הביצית לבלתי חדירה לנוגדנים.

....

פרוטוקול

הערה: ההליכים מתבצעים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. חממות שבשליטת טמפרטורה משמשים כדי לשמור על טמפרטורות עבור גידול זבוב וחוצה אלא אם צוין אחרת.

1. הכנות

1. הכן זבובים.
   1. Prometaphase מועשר אוספי ביצית.
      1. מבוגר מנקה זבובים מתרבויות מניות או צלב בריאות, צעירות. בקבוקי גיל ליומיים של 25 מעלות צלזיוס.
         הערה: באופן כלל....

תוצאות

השיטות שתיארנו כאן תוביל גביית ביציות תסיסנית בשלב מאוחר המייצגים שלושה שלבי המיוזה (איור 1). ביציות ב prophase מאופיינים בנוכחות מעטפת הגרעין, אשר גלוי על ידי חוסר האות טובולין באזור המקיף את karyosome (איור 1 א). Prometaphase היא התקופה לאחר התמוטטות מעטפת גרעין שבמהלכו מרכיב הכישור. במהלך prometaphase, את karyosome לובשת צורה ייחודית, נעשה ארוך מדי לעתים קרובות עם 4 הכרומוזומים ^ה מלבד המסה ka.......

דיון

Staging תסיסנית ביציות

אם כי karyosome מוארך נראה בדרך כלל ב ביציות prometaphase, באמצעות karyosome צורה להבחין prometaphase מ ביציות metaphase יכול להיות בעייתי. במהלך prometaphase, את karyosome מתחיל כמו צורה עגולה, מתארך, ולאחר מכן חזר בו כדי צורה עגולה כמו הביצית מתקרבת מעצר metaphase. משמעות הדבר היא כי רבים ביציות prometaphase אין לי karyosome מוארך. בנוסף, אם ביציות מוטציה או מטופ.......

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
15 מ"ל צינורות חרוטיים	שונים
16% פורמלדהיד	טד פלה, בע"מ	18505	מסוכן; לאחר הפתיחה, יש להשליך לאחר חודש
250 מ"ל כוסות	שונות
של 5 מ"ל שמרים
			מערבבים עם מים ליצירת משחה העקביות של
נוגדן חמאת בוטנים נגד &אלפא טובולין מצומד לשיבוט FITC	Sigma	F2168	DM1A
Binucleine 2	סיגמא	B1186	בלנדר מסוכן
אלבומין סרום בקר
סידן כלורי	קולכיצין שונים
	סיגמא	C-9754
כיסויים	VWR	48366-227	מס' 1 1/2
DMSO	מגוון
EGTA
	שונים
	טד פלה, בע"מ	5622	פינצטה דומונט דיוק גבוה בסגנון 5
פורממיד	סיגמא	47670-250ML-F
שקופיות זכוכית	VWR	48312-003
גלוקוז
1.5 מ"ל צינורות
HEPES	VWR	EM-5330	זמינים ממספר ספקים
Hoechst 33342	שונים
מתנול	שונים
m)	VWR	AA43657-NK	מגוון פורמטים וספקים אחרים, 12 או 14
רשת רשת קטנה (~ 300 ומיקרו; m)	מעבדות ספקטרום	146 424	מגוון פורמטים, למשל , 146 422 או 146 486
nutator
אשלגן אצטט
	Sigma	C0125	מסוכן; לחלופין, נתרן קקודילאט עשוי להיות מוחלף
הידרוקסיד
נתרן כלורי
נתרן הידרוקסיד
	שונים
סוכרוז	שונים
טריטון X-100	פישר	PI-28314
טווין 20	פישר	PI-28320
מערבולת	שונות

יבשים פעילים שונים שונים סיגמא A4161 מסוכנים דקסטרן סולפט שונים אתנול מלקחיים בוגרים שונים שונים מגנזיום כלוריד רשתות גדולות שונות (~1,500 & מיקרו; פיפטות פסטר שונות שונות חומצה קקודילית שונות באשלגן נתרן אצטט שונים נתרן ציטראט שונים טקסול שונים (פקליטקסל) סיגמא T1912 מסוכן