Utnytte Etylen-frigjørende forbindelse, 2-Chloroethylphosphonic Acid, som et verktøy for å studere Etylen Response i Bakterier
Summary
The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.
Abstract
Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.
Introduction
Olefinet etylen (C 2 H 4) ble først oppdaget som en plante hormon i 1901 da det ble observert at ert frøplanter, dyrket i et laboratorium som brukes kull gass lamper, oppviste en unormal morfologi hvori stengler (hypocotyls) var kortere, tykkere og bøyd sidelengs i forhold til normal ert frøplanter; en fenotype senere kalt trippel respons 1,2. Etterfølgende studier viste at etylen er et viktig phytohormone som regulerer mange utviklingsmessige prosesser som for eksempel vekst, stressrespons, fruktmodning og senescens 3. Arabidopsis thaliana, modellorganisme for plantebiologi forskning, har blitt godt undersøkt i forhold til sitt svar til etylen. Flere etylen respons mutanter har blitt isolert ved å utnytte trippel respons fenotype observert i mørke vokst A. thaliana planter i nærvær av etylen 1,4,5. Den biosyntetisk forløper for etylenproduksjon i planter er 1-enminocyclopropane karboksylsyre (ACC) 6, og brukes vanligvis i løpet av tre reaksjon assay for å øke endogen etylenproduksjon som fører til trippel respons fenotype 1,4,5.
Selv om etylen responsen er mye studert i planter, er effekten av eksogene etylen på bakterier langt studerte til tross for tett sammenslutning av bakterier med planter. En studie rapporterte at visse Pseudomonas-stammer som kan overleve ved anvendelse av etylen som en eneste kilde for karbon og energi 7. Imidlertid har bare to studier har vist at bakterier svare til etylen. Den første studien viste at stammer av Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, og P. syringae var kjemotaktiske mot etylen ved hjelp av en agarose-plugg analyse hvor det smeltede agarose ble blandet med en kjemotaksis-buffer ekvilibrert med ren etylengass 8. Men til vår kunnskap, har det ikke vært noen Furthere rapporter ved hjelp av ren etylengass for å karakterisere bakteriell etylen respons, sannsynligvis på grunn av den så lett å håndtere gasser i laboratoriet uten spesialutstyr. Den andre rapporten fra bakteriell etylen respons viste at etylen økt bakteriell cellulose produksjon og påvirket genuttrykk i frukt-assosiert bakterien, Komagataeibacter (tidligere Gluconacetobacter) xylinus 9. I dette tilfellet er den etylen-frigjørende forbindelse, 2-chloroethylphosphonic syre (CEPA) ble anvendt for å fremstille etylen in situ inne i bakterievekstmedium, omgå behovet for ren etylengass eller spesialisert utstyr.
CEPA produserer etylen ved et 1: 1 molart forhold over pH 3,5 10,11 via en base-katalysert, førsteorden-reaksjon 12 – 14. Nedbrytningen av CEPA er positivt korrelert med pH og temperatur 13,14 og resulterer i produksjon av etylen, klorid og fosfat. CEPA gir forskere interessert i å studere bakteriesvar til etylen med et praktisk alternativ til gass etylen.
Det overordnede målet for følgende protokoller er å gi en enkel og effektiv metode for å studere bakteriell etylen respons og inkluderer validering av fysiologisk relevante nivåer av etylenproduksjonen fra CEPA nedbrytning i bakterievekst medium, til analyse av kultur pH sikre CEPA dekomponering ikke er svekket i løpet av bakterievekst og vurdering av effekten av etylen på bakteriell morfologi og fenotype. Vi viser disse protokollene ved hjelp K. xylinus, men disse protokollene kan tilpasses for å studere etylen respons i andre bakterier ved anvendelse av det egnede vekstmedium og fenotype analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene som beskrives her skissere in situ fremstilling av etylen fra CEPA for studier av bakteriell etylen respons ved bruk av modellorganisme, K. xylinus. Denne metoden er meget anvendelig som etylen, kan fremstilles ved å supplere hvilket som helst vandig medium som har en pH større enn 3,5 10,11 med CEPA oppheve behovet for ren etylengass eller spesialisert laboratorieutstyr. Denne metoden er ikke begrenset til å studere effekten av CEPA-avledede etylen på bakterier, men kan også t…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.
Materials
| 1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC) | Sigma | A3903 | Biosynthetic precursor of ethylene in plants |
| 4-sector Petri dish | Phoenix Biomedical | CA73370-022 | For testing triple response |
| Agar | BioShop | AGR001.1 | To solidify medium |
| Canon Rebel T1i DLSR camera | Canon | 3818B004 | For pictures of pellicles |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | Sigma | C2730 | Aqueous solution |
| Citric acid | BioShop | CIT002.500 | For SH medium |
| Commercial bleach | Life Brand | 57800861874 | Bleach for seed sterilization |
| Concentrated HCl | BioShop | HCL666.500 | Hydrochloric acid for pH adjustment |
| Digital USB microscope | Plugable | N/A | For pictures of colonies |
| Ethephon (≥ 96%; 2-chloroethylphosphonic acid) | Sigma | C0143 | Ethylene-releasing compound |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | For SH medium |
| Komagataeibacter xylinus ATCC 53582 | ATCC | 53582 | Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium |
| Microcentrifuge tube | LifeGene | LMCT1.7B | 1.7 mL microcentrifuge tube |
| Murashige and Skoog (MS) basal medium | Sigma | M5519 | Arabidopsis thaliana growth medium |
| Na2HPO4·7H2O | BioShop | SPD579.500 | Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium |
| NaCl | BioBasic | SOD001.1 | Sodium chloride for saline and control solution |
| NaH2PO4·H2O | BioShop | SPM306.500 | Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution |
| NaOH | BioShop | SHY700.500 | Sodium hydroxide for pH adjustment |
| Paraffin film | Parafilm | PM996 | For sealing plates and flasks |
| Peptone (bacteriological) | BioShop | PEP403.1 | For SH medium |
| Petroff-Hausser counting chamber | Hausser scientific | 3900 | Bacterial cell counting chamber |
| Polyethersulfone sterilization filter 0.2 µm | VWR | 28145-501 | For sterilizing cellulase |
| Sucrose | BioShop | SUC600.1 | Sucrose for MS medium |
| Yeast extract | BioBasic | G0961 | For SH medium |
References
- Guzmán, P., Ecker, J. R. Exploiting the triple response of Arabidopsis to identify ethylene-related mutants. Plant Cell. 2 (6), 513-523 (1990).
- Bakshi, A., Shemansky, J. M., Chang, C., Binder, B. M. History of research on the plant hormone ethylene. J. Plant Growth Regul. 34 (4), 809-827 (2015).
- Schaller, G. E. Ethylene and the regulation of plant development. BMC Biol. 10 (1), (2012).
- Hua, J., Sakai, H., et al. EIN4 and ERS2 are members of the putative ethylene receptor gene family in Arabidopsis. Plant Cell. 10 (8), 1321-1332 (1998).
- Bleecker, A. B., Estelle, M. A., Somerville, C., Kende, H. Insensitivity to ethylene conferred by a dominant Mutation in Arabidopsis thaliana. Science. 241 (4869), 1086-1089 (1988).
- Hamilton, A. J., Bouzayen, M., Grierson, D. Identification of a tomato gene for the ethylene-forming enzyme by expression in yeast. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (16), 7434-7437 (1991).
- Kim, J. Assessment of ethylene removal with Pseudomonas strains. J. Hazard. Mater. 131 (3), 131-136 (2006).
- Kim, H. E., Shitashiro, M., Kuroda, A., Takiguchi, N., Kato, J. Ethylene chemotaxis in Pseudomonas aeruginosa and other Pseudomonas species. Microbes Environ. 22 (2), 186-189 (2007).
- Augimeri, R. V., Strap, J. L. The phytohormone ethylene enhances bacterial cellulose production, regulates CRP/FNRKx transcription and causes differential gene expression within the cellulose synthesis operon of Komagataeibacter (Gluconacetobacter) xylinus ATCC 53582. Front. Microbiol. 6, 1459 (2015).
- Zhang, W., Wen, C. K. Preparation of ethylene gas and comparison of ethylene responses induced by ethylene, ACC, and ethephon. Plant Physiol. Biochem. 48 (1), 45-53 (2010).
- Zhang, W., Hu, W., Wen, C. K. Ethylene preparation and its application to physiological experiments. Plant Signal. Behav. 5 (4), 453-457 (2010).
- Warner, H. L., Leopold, A. C. Ethylene evolution from 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 44 (1), 156-158 (1969).
- Biddle, E., Kerfoot, D. G. S., Kho, Y. H., Russell, K. E. Kinetic studies of the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid in aqueous solution. Plant Physiol. 58 (5), 700-702 (1976).
- Klein, I., Lavee, S., Ben-Tal, Y. Effect of water vapor pressure on the thermal decomposition of 2-chloroethylphosphonic acid. Plant Physiol. 63 (3), 474-477 (1979).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Schramm, M., Hestrin, S. Factors affecting production of cellulose at the air/liquid interface of a culture of Acetobacter xylinum. J. Gen. Microbiol. 11 (1), 123-129 (1954).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ciolacu, D., Ciolacu, F., Popa, V. I. Amorphous cellulose-structure and characterization. Cellul. Chem. Technol. 45 (1), 13-21 (2011).
