This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
एक प्रोटीन की संरचना चतुर्धातुक कई सेलुलर प्रक्रियाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। संकेत दे रास्ते, जीन अभिव्यक्ति, और एंजाइम सक्रियण / छोड़ना सभी प्रोटीन परिसरों 1-4 की उचित विधानसभा पर भरोसा करते हैं। इस प्रक्रिया को भी होमो या असमलैंगिक oligomerization के रूप में जाना अपरिवर्तनीय सहसंयोजक या प्रतिवर्ती इलेक्ट्रोस्टैटिक और हाइड्रोफोबिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के कारण है। Oligomerization न केवल जीनोम आकार में वृद्धि के बिना अलग सेलुलर प्रक्रियाओं diversifies, लेकिन प्रोटीन स्थिर परिसरों कि विकृतीकरण और गिरावट 5 के प्रति अधिक प्रतिरोधी रहे हैं का निर्माण करने के लिए भी एक रणनीति है। oligomerization में दोष प्रोटीन के समारोह पर प्रभाव पड़ता है और रोगों के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एंजाइम फेनिलएलनिन hydroxylase एक tetrameric जटिल रूपों। प्रोटीन परिसर के भीतर कुछ उत्परिवर्तन टेट्रामर गठन को कमजोर और रोग phenylketonuria 6 के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
<p clasएस = "jove_content"> मानव MXA प्रोटीन एंटीवायरल प्रेरक प्रोटीन विभिन्न आरएनए के खिलाफ एक व्यापक एंटीवायरल गतिविधि exerting के साथ ही डीएनए वायरस 7 प्रेरित एक इंटरफेरॉन (IFN) है। यह dynamin-जैसे बड़े GTPases की superfamily के अंतर्गत आता है और क्षमता विट्रो 8 में बड़े oligomeric संरचनाओं फार्म है। Oligomerization तेजी से गिरावट 9,10 से MXA की रक्षा करने के लिए सुझाव दिया गया है। कई अनुसंधान समूहों द्वारा तीव्र प्रयासों के बावजूद कार्रवाई की आणविक तंत्र काफी हद तक मायावी बनी हुई है और इसकी एंटीवायरल समारोह के लिए MXA की oligomerization राज्य की भूमिका बहस 9,11,12 के अधीन है। इस संबंध में, गाओ और सहकर्मियों एक मॉडल जहां MXA बड़े अंगूठी की तरह oligomeric संरचनाओं 11 के रूप में वायरल nucleoproteins के साथ बातचीत के द्वारा अपने एंटीवायरल गतिविधि डालती का प्रस्ताव रखा। हालांकि, हाल ही में, हम दिखा दिया कि MXA dimers एंटीवायरल गतिविधि प्रदर्शन और इन्फ्लूएंजा ए वायरस 12 के nucleoprotein के साथ बातचीत। बीMXA की क्रिस्टल संरचना पर ased, गाओ और सहकर्मियों इंटरफेस क्षेत्रों है कि इन विट्रो में अपनी oligomerization और उसके एंटीवायरल समारोह 11,13 के लिए महत्वपूर्ण हैं में कई अमीनो एसिड के अवशेष की पहचान की। इसलिए, ताकि स्पष्ट करने के लिए जो MXA की oligomeric राज्य एंटीवायरल गतिविधि डालती में, हम एक सरल प्रोटोकॉल तेजी से MXA इंटरफेस के रूप में अच्छी तरह से मानव कोशिकाओं में व्यक्त के रूप में अंतर्जात MXA IFNα उत्तेजना के बाद व्यक्त म्यूटेंट के oligmeric स्थिति का निर्धारण करने के लिए स्थापित करने की मांग की।हालांकि कई तकनीकों है कि आमतौर पर इस तरह के विभाजन हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के रूप में प्रोटीन के बीच बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं देखते हैं (विभाजन GFP) पूरक परख 14, सतह plasmon अनुनाद 15 और Förster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) 16, वे प्रदान नहीं करते एक oligomeric प्रोटीन जटिल की सटीक stoichiometry की जानकारी। इस विशेष पहलू की जांच के लिए, तकनीक जैसेबहु कोण प्रकाश बिखरने (MALS) 17 और विश्लेषणात्मक ultracentrifugation 18 बहुत उपयोगी होते हैं। आमतौर पर, प्रोटीन इन तरीकों का उपयोग कर विश्लेषण शुद्ध प्रोटीन होते हैं। Oligomerization प्रक्रियाओं को भी अन्य सेलुलर कारकों पर निर्भर हो सकता है। इन कारकों में अज्ञात हैं, विश्लेषण और अधिक कठिन है। साथ ही, कुछ प्रोटीन ई में व्यक्त करने के लिए मुश्किल हो जाता है कोलाई और शुद्ध करने के लिए। इसलिए, इन तरीकों सेलुलर वातावरण में प्रोटीन oligomerization विश्लेषण करने के लिए इष्टतम पसंद नहीं कर रहे हैं। इसके अलावा, इन तकनीकों के महंगे उपकरण है जो आसानी से उपलब्ध नहीं हैं की आवश्यकता होती है।
गैर denaturing जेल वैद्युतकणसंचलन (पृष्ठ), आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी या रासायनिक crosslinking पारंपरिक सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) -PAGE के द्वारा पीछा सेल lysates 2,19,20 से oligomers के गठन के लक्षण वर्णन के लिए उपयोगी उपकरण हैं। इन तरीकों में विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है और आसानी से पीई हो सकता हैएक मानक प्रयोगशाला में rformed। हम शुरू में विभिन्न रासायनिक पार से जोड़ने प्रोटोकॉल है कि invariantly गैर विशिष्ट एकत्रीकरण और MXA की वर्षा करने के लिए नेतृत्व का मूल्यांकन किया। इसलिए, हम अगले गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ प्रोटोकॉल का परीक्षण किया। गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ एसडीएस के उपयोग को शामिल नहीं किया है, प्रोटीन के प्रवास के उनके पैतृक आरोप पर निर्भर करता है। ब्लू-देशी पृष्ठ एक समग्र नकारात्मक चार्ज, एसडीएस के समान के साथ प्रोटीन लोड करने के लिए coomassie खूब ब्लू G250 उपयोग करता है, लेकिन प्रोटीन 21 denature नहीं है। दुर्भाग्य से, उच्च लवण और द्विसंयोजक फैटायनों (जैसे 2 मिलीग्राम +) है कि अक्सर सेल बफ़र्स में शामिल किए गए हैं की उपस्थिति में खूब ब्लू अवक्षेप coomassie। इस्तेमाल किया बफ़र्स पर निर्भर करता है, यह एक उपाय है oligomeric प्रोटीन परिसर पर असर पड़ सकता है की आगे अनुकूलन के बिना नमूना विश्लेषण करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
यहाँ हम एक सरल एक पहले प्रकाशित विधि 22 के oligomerization निर्धारित करने के आधार पर प्रोटोकॉल प्रस्तुतमानव MXA प्रोटीन गैर अप्राकृतिकरण पृष्ठ का उपयोग सेलुलर lysates से निकाली गई।
Here we describe a simple method that allows the rapid determination of the oligomeric state of proteins expressed in mammalian cells by non-denaturing PAGE followed by Western blot analysis. The major advantage of this approach is that the oligomeric state of a given protein can be determined from whole cell lysates without prior protein purification. This may be important for proteins that oligomerize or exert their function in association with auxiliary factors. In addition, the proteins are still in their native stat…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
Milk powder | Migros/Switzerland | ||
Methanol | Millipore | 1.06009 | |
sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |