Karakterisering van Multi-subunit eiwitcomplexen of Human MxA het gebruik van niet-denaturerende Polyacrylamide Gel-elektroforese
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
De quaternaire structuur van een eiwit speelt een cruciale rol in vele cellulaire processen. Signaalwegen, genexpressie en enzymactivering / deactivering allemaal afhankelijk van de juiste montage van eiwitcomplexen 1-4. Dit proces ook bekend als homo- of hetero-oligomerisatie wordt veroorzaakt door irreversibele covalente of omkeerbare elektrostatische en hydrofobe eiwit-eiwit interacties. Oligomerisatie diversifieert niet alleen de verschillende cellulaire processen zonder genoomgrootte verhogen, maar ook een strategie voor eiwitten stabiele complexen die resistenter voor denaturatie en degradatie 5 zijn gebouwd. Defecten in oligomerisatie van invloed op de functie van eiwitten en kan leiden tot de ontwikkeling van ziekten. Bijvoorbeeld het enzym fenylalanine hydroxylase vormt een tetrameer complex. Sommige mutaties in het eiwitcomplex de vorming tetrameer verzwakken en leiden tot de ziekte fenylketonurie 6.
<p class = "jove_content"> De menselijke MxA eiwit een interferon (IFN) geïnduceerde antivirale effectoreiwit uitoefenen van een brede antivirale activiteit tegen verschillende RNA en DNA-virussen 7. Het behoort tot de superfamilie van dynamin-achtige GTPases groot en heeft de capaciteit om grote oligomere structuren in vitro 8. Oligomerisatie is voorgesteld om MxA te beschermen tegen snelle afbraak 9,10. Ondanks intensieve inspanningen van vele onderzoeksgroepen, de moleculaire werkingsmechanisme blijft grotendeels ongrijpbaar en de rol van de oligomerisatie toestand van MxA voor zijn antivirale functie is onder debat 9,11,12. In dit verband, Gao en medewerkers voorgesteld een model waarbij MxA oefent zijn antivirale activiteit door interactie met virale kerneiwitten in vorm van grote ringachtige oligomere structuren 11. Echter, meer recentelijk, hebben we aangetoond dat MxA dimeren vertonen antivirale werking en interactie met het nucleoproteïne van influenza A virus 12. Based op de kristalstructuur van MxA, Gao en collega's identificeerden verschillende aminozuurresten in de grensvlakgebieden die essentieel zijn voor de oligomerisatie in vitro en zijn antivirale werking 11,13 zijn. Teneinde op te helderen die oligomere toestand van MxA antivirale activiteit uitoefent, zochten wij een eenvoudig protocol om de oligmeric staat MxA interface-mutanten tot expressie gebracht in humane cellen als endogeen MxA uitgedrukt IFNa na stimulatie snel vast te stellen.Hoewel er vele technieken die gewoonlijk worden gebruikt om de interactie tussen eiwitten bestuderen die de split-Green Fluorescent Protein (split-GFP) complementatie bepaling 14, oppervlak plasmon resonantie 15 en Förster resonantie energieoverdracht (FRET) 16, ze geen informatie over de exacte stoichiometrie van een oligomeer eiwitcomplex. Voor het onderzoek van dit aspect technieken zoalsmulti-angle lichtverstrooiing (Mals) 17 en analytische ultracentrifugatie 18 zijn zeer nuttig. Gewoonlijk zijn de eiwitten geanalyseerd met behulp van deze werkwijzen gezuiverde eiwitten. Oligomerisatie processen kunnen ook afhangen van andere cellulaire factoren. Als deze factoren zijn bekend, de analyse bemoeilijkt. Bovendien hebben sommige eiwitten moeilijk in E. coli en te zuiveren. Daarom zijn deze werkwijzen niet de optimale keuze eiwit oligomerisatie analyseren de cellulaire omgeving. Bovendien zijn deze technieken vereisen dure instrumenten die niet gemakkelijk beschikbaar zijn.
Niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese (PAGE), grootte-uitsluitingschromatografie of chemische verknoping gevolgd door gebruikelijke natrium dodecylsulfaat (SDS) -PAGE zijn nuttige hulpmiddelen voor het karakteriseren van de vorming van oligomeren van cellysaten 2,19,20. Deze methoden vereisen geen gespecialiseerde apparatuur en kan gemakkelijk worden performed in een standaard laboratorium. We eerst geëvalueerd verschillende chemische verknoping protocollen die invariant tot aspecifieke aggregatie en precipitatie van MxA. Daarom hebben we de volgende geteste niet-denaturerende PAGE protocollen. Als niet-denaturerende PAGE gebruik van SDS uitsluit, de migratie van eiwitten afhankelijk van hun oorspronkelijke lading. Blauw-natieve PAGE gebruikt Coomassie brilliant blue G250 eiwitten met een totale negatieve lading, vergelijkbaar met SDS laden, maar niet het eiwit 21 denatureren. Helaas, Coomassie Brilliant blauw precipitaat in aanwezigheid van hoge zouten en tweewaardige kationen (bijvoorbeeld Mg 2+) die vaak in lysis buffers. Afhankelijk van de gebruikte buffers, kan het moeilijk zijn om het monster zonder verdere optimalisering van stappen die een effect op het oligomeer eiwitcomplex konden analyseren.
Hier presenteren we een eenvoudig protocol op basis van een eerder gepubliceerde werkwijze 22 voor oligomerisatie van bepalenhuman MxA eiwit afkomstig van cellysaten met behulp van niet-denaturerende PAGE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een eenvoudige methode die de snelle bepaling van de oligomere toestand van eiwitten in zoogdiercellen tot expressie gebracht door niet-denaturerende PAGE gevolgd door Western blot analyse. Het grote voordeel van deze aanpak is dat de oligomere status van een bepaald eiwit kan worden bepaald uit gehele cellysaten zonder voorafgaande eiwitzuivering. Dit kan belangrijk zijn voor eiwitten die oligomeriseren of hun functie in associatie uitoefenen met aanvullende factoren. Bovendien zijn de eiwitten nog …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
