非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いたヒトのMxAのマルチサブユニットタンパク質複合体のキャラクタリゼーション
Summary
This article describes a simple and rapid protocol to evaluate the oligomeric state of the dynamin-like GTPase MxA protein from lysates of human cells using a combination of non-denaturing PAGE with western blot analysis.
Abstract
The formation of oligomeric complexes is a crucial prerequisite for the proper structure and function of many proteins. The interferon-induced antiviral effector protein MxA exerts a broad antiviral activity against many viruses. MxA is a dynamin-like GTPase and has the capacity to form oligomeric structures of higher order. However, whether oligomerization of MxA is required for its antiviral activity is an issue of debate. We describe here a simple protocol to assess the oligomeric state of endogenously or ectopically expressed MxA in the cytoplasmic fraction of human cell lines by non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) in combination with Western blot analysis. A critical step of the protocol is the choice of detergents to prevent aggregation and/or precipitation of proteins particularly associated with cellular membranes such as MxA, without interfering with its enzymatic activity. Another crucial aspect of the protocol is the irreversible protection of the free thiol groups of cysteine residues by iodoacetamide to prevent artificial interactions of the protein. This protocol is suitable for a simple assessment of the oligomeric state of MxA and furthermore allows a direct correlation of the antiviral activity of MxA interface mutants with their respective oligomeric states.
Introduction
タンパク質の四次構造は、多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしています。シグナル伝達経路、遺伝子発現、および酵素活性化/非活性化は、すべてのタンパク質複合体1-4の適切なアセンブリに頼ります。また、ホモまたはヘテロオリゴマーとして知られるこのプロセスは不可逆的共有結合または可逆的な静電および疎水性のタンパク質 – タンパク質相互作用に起因します。オリゴマー化は、ゲノムサイズを大きくすることなく、異なる細胞過程を多様化するだけでなく、変性および劣化5に対してより耐性である安定な複合体を構築するためのタンパク質のための戦略を提供するだけでなく。オリゴマー化の欠陥は、タンパク質の機能に影響を与え、疾患の発症をもたらすことができます。例えば、酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼは、四量体複合体を形成します。タンパク質複合体の中のいくつかの変異は、四量体形成を弱め、病気のフェニルケトン6につながることができます。
<p clasS = "jove_content">人間のMxAタンパク質は、抗ウイルス、様々なRNAに対する幅広い抗ウイルス活性を発揮するエフェクタータンパク質ならびにDNAウイルス7を誘発インターフェロン（IFN）です。これは、ダイナミンのような大GTPアーゼのスーパーファミリーに属し、 インビトロ 8 に大きなオリゴマー構造を形成する能力を有します。オリゴマー化は、迅速な分解9,10からのMxAを保護するために提案されています。多くの研究グループによる激しい努力にもかかわらず、作用の分子機構は、主にとらえどころのないままで、その抗ウイルス機能のためのMxAのオリゴマー化状態の役割が議論9,11,12の下にあります。この点で、ガオと共同研究者は、MxAのが大きなリング状オリゴマー構造11の形でウイルス核タンパク質と相互作用することにより、その抗ウイルス活性を発揮するモデルを提案しました。しかし、最近では、我々は、のMxA二量体が抗ウイルス活性を示し、インフルエンザウイルス12の核タンパク質と相互作用することを実証しました。 BMxAの結晶構造にASED、ガオと共同研究者は、in vitroで 、そのオリゴマー化およびその抗ウイルス機能11,13のために重要である界面領域におけるいくつかのアミノ酸残基を同定しました。したがって、抗ウイルス活性を発揮するのMxAのオリゴマーいる状態解明するために、我々は、急速に、内因性のMxAはIFNα刺激後に発現並びにヒト細胞において発現のMxAインタフェース変異体のoligmeric状態を決定するための簡単なプロトコルを確立しようとしました。一般に、スプリット緑色蛍光タンパク質などのタンパク質の間の相互作用を研究するために使用される多くの技術があるが（スプリット-GFP）相補性アッセイ14、表面プラズモン共鳴15と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）16、それらが提供していませんオリゴマータンパク質複合体の正確な化学量論の情報。この特定の側面の調査のため、技術など多角度光散乱（MALS）17および分析超遠心分離18は非常に便利です。通常、これらの方法を用いて分析したタンパク質は、精製されたタンパク質です。オリゴマー化プロセスは、他の細胞因子に依存し得ます。これらの要因が不明である場合は、解析がより困難です。さらに、いくつかのタンパク質は、 大腸菌で発現することが困難であり、 coliおよび精製します。したがって、これらの方法は、細胞環境におけるタンパク質のオリゴマー化を分析するための最適な選択肢ではありません。また、これらの技術は容易に入手できない高価な機器を必要とします。
非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）、サイズ排除クロマトグラフィー又は従来のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-PAGEに続く化学的架橋は、細胞溶解物2,19,20からのオリゴマーの形成の特徴付けのために有用なツールです。これらの方法は、特別な装置を必要とせず、簡単にPEすることができます標準的な実験室でrformed。我々は、最初に不変非特異的凝集のMxAの沈殿を導いた種々の化学架橋プロトコルを評価しました。したがって、我々は次の非変性PAGEプロトコルをテストしました。非変性PAGEは、SDSの使用を排除するように、タンパク質の移動は、母国の電荷に依存します。ブルーネイティブPAGEは、SDSに似て全体的に負電荷を有するタンパク質をロードするためにクーマシーブリリアントブルーG250を使用しますが、タンパク質21を変性させません。残念ながら、多くの場合、溶解緩衝液に含まれている（ 例えば、マグネシウム2+）高塩および二価カチオンの存在下で鮮やかな青色の沈殿物をクーマシー。使用される緩衝剤によっては、オリゴマータンパク質複合体に影響を与える可能性の手順をさらに最適化することなくサンプルを分析することは困難です。
ここでは、のオリゴマー化を決定するために、以前に発表された方法22に基づいて簡単なプロトコルを提示非変性PAGEを使用して細胞溶解物由来のヒトのMxAタンパク質。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、ウェスタンブロット分析を行った非変性PAGEによって哺乳動物細胞で発現するタンパク質のオリゴマー状態の急速な決意を可能にする簡単な方法を説明します。このアプローチの主な利点は、所定のタンパク質のオリゴマー状態は、従来のタンパク質精製せずに全細胞溶解物から決定することができるということです。これは、オリゴマー化または補助因子に関連してその機能を発…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a Grant from the Swiss National Science foundation (Grant nr. 31003A_143834) to JP.
Materials
| Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Units, 10K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher Scientific | 69570 | Pre-equilibrate in dialysis buffer ( if Glycerol removal is desired) Can be self-made according to Fiala et al. 2011 |
| 4–15% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, | Bio-Rad | 456-1083 | Pre-run in running buffer to adjust buffer system |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | use 1 tablet per 50 ml |
| PBS, pH 7.4 bottle a 500ml Gibco | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| Ponceau S solution | Sigma-Aldrich | P7170 | toxic! wear gloves and protect eyes! |
| NativeMark Unstained Protein Standard 50ul | Invitrogen | P/N 57030 | load 5 ul/well |
| A549 cells | ATCC | ATCC CCL185 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| Vero cells | ATCC | ATCC CCL81 | Grow in growth medium (see Table 1) |
| anti-Mx1 antibody | Novus Biologicals | H00004599_D01P | Use at a 1:1000 dilution |
| ECL Anti-rabbit IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody (from donkey) | GE-Healthcare | NA934V | Use at a 1:10000 dilution |
| 0.5% Trypsin-EDTA (1x) Life Technologies | Thermo Fisher | 15400-054 | |
| Iodoacetamide 5g | Sigma-Aldrich | I-6125 | stock 100mM |
| Bromphenolblue | Sigma-Aldrich | B0126-25G | |
| DMEM +4.5g/l Gluc,+L-Glut,+Pyruvate life technologies | Thermo Fisher Scientific | 41966-029 | |
| Pen Strep 100 x 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 15140 – 130 | |
| Glutamax 100xStock, 100ml life technologies | Thermo Fisher Scientific | 350500-038 | |
| Fetal Bovine Serum, Dialyzed , US Origin 500ml Gibco Lot:42G9552K | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Cellulose filter paper | Bio-Rad | 1703965 | |
| PVDV blotting membrane | GE-Healthcare | 10600022 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Biosolve | 0020092391BS | |
| sodium fluoride (NaF) | Sigma Aldrich | S-7920 | |
| NP-40 | Calbiochem | 492015 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free | Roche | 11836170001 | |
| Tween 20 | Calbiochem | 6555204 | |
| CHAPS 10% solution | Amresco | N907 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | 43819 | |
| Glycine | Biosolve | 0007132391BS | |
| sodium orthovanadate (Na3VO4) | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G7757 | |
| b-Glycerophospate | Sigma Aldrich | G9422 | |
| Milk powder | Migros/Switzerland | ||
| Methanol | Millipore | 1.06009 | |
| sodium cloride (NaCl) | Sigma Aldrich | 71380 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Amresco | 288 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Sigma Aldrich | L4509 | |
| sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S-8045 |
References
- Baisamy, L., Jurisch, N., Diviani, D. Leucine zipper-mediated homo-oligomerization regulates the Rho-GEF activity of AKAP-Lbc. J Biol Chem. 280, 15405-15412 (2005).
- Chen, C. P., Posy, S., Ben-Shaul, A., Shapiro, L., Honig, B. H. Specificity of cell-cell adhesion by classical cadherins: Critical role for low-affinity dimerization through beta-strand swapping. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8531-8536 (2005).
- Jackson-Fisher, A. J., Chitikila, C., Mitra, M., Pugh, B. F. A role for TBP dimerization in preventing unregulated gene expression. Mol Cell. 3, 717-727 (1999).
- Torshin, I. Activating oligomerization as intermediate level of signal transduction: analysis of protein-protein contacts and active sites in several glycolytic enzymes. Front Biosci. 4, 557-570 (1999).
- Goodsell, D. S., Olson, A. J. Structural symmetry and protein function. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 29, 105-153 (2000).
- Flydal, M. I., Martinez, A. Phenylalanine hydroxylase: function, structure, and regulation. IUBMB Life. 65, 341-349 (2013).
- Haller, O., Kochs, G. Human MxA protein: an interferon-induced dynamin-like GTPase with broad antiviral activity. J Interferon Cytokine Res. 31, 79-87 (2011).
- Haller, O., Staeheli, P., Schwemmle, M., Kochs, G. Mx GTPases: dynamin-like antiviral machines of innate immunity. Trends Microbiol. 23, 154-163 (2015).
- Di Paolo, C., Hefti, H. P., Meli, M., Landis, H., Pavlovic, J. Intramolecular backfolding of the carboxyl-terminal end of MxA protein is a prerequisite for its oligomerization. J Biol Chem. 274, 32071-32078 (1999).
- Janzen, C., Kochs, G., Haller, O. A monomeric GTPase-negative MxA mutant with antiviral activity. J Virol. 74, 8202-8206 (2000).
- Gao, S., et al. Structure of myxovirus resistance protein a reveals intra- and intermolecular domain interactions required for the antiviral function. Immunity. 35, 514-525 (2011).
- Nigg, P. E., Pavlovic, J. Oligomerization and GTP-binding Requirements of MxA for Viral Target Recognition and Antiviral Activity against Influenza A Virus. J Biol Chem. 290, 29893-29906 (2015).
- Gao, S., et al. Structural basis of oligomerization in the stalk region of dynamin-like MxA. Nature. 465, 502-506 (2010).
- Ghosh, I., Hamilton, A. D., Regan, L. Antiparallel leucine zipper-directed protein reassembly: Application to the green fluorescent protein. J Am Chem Soc. 122, 5658-5659 (2000).
- Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterisation of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta. 1838, 43-55 (2014).
- Kenworthy, A. K. Imaging protein-protein interactions using fluorescence resonance energy transfer microscopy. Methods. 24, 289-296 (2001).
- Wyatt, P. J. Light-Scattering and the Absolute Characterization of Macromolecules. Analytica Chimica Acta. 272 (93), 1-40 (1993).
- Howlett, G. J., Minton, A. P., Rivas, G. Analytical ultracentrifugation for the study of protein association and assembly. Curr Opin Chem Biol. 10, 430-436 (2006).
- Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. , (2011).
- Zou, H., Li, Y., Liu, X., Wang, X. An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem. 274, 11549-11556 (1999).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217, 220-230 (1994).
- Walker, J. M. Nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis of proteins. Methods Mol Biol. 32, 17-22 (1994).
- Stoscheck, C. M. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 182, 50-68 (1990).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. Interferon-induced antiviral protein MxA interacts with the cellular RNA helicases UAP56 and URH49. J Biol Chem. 286, 34743-34751 (2011).
- Stertz, S., et al. Interferon-induced, antiviral human MxA protein localizes to a distinct subcompartment of the smooth endoplasmic reticulum. J Interferon Cytokine Res. 26, 650-660 (2006).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666, 105-117 (2004).
- Kochs, G., Haener, M., Aebi, U., Haller, O. Self-assembly of human MxA GTPase into highly ordered dynamin-like oligomers. J Biol Chem. 277, 14172-14176 (2002).
- Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274, 4370-4376 (1999).
- Reichelt, M., Stertz, S., Krijnse-Locker, J., Haller, O., Kochs, G. Missorting of LaCrosse virus nucleocapsid protein by the interferon-induced MxA GTPase involves smooth ER membranes. Traffic. 5, 772-784 (2004).
- Wisskirchen, C., Ludersdorfer, T. H., Muller, D. A., Moritz, E., Pavlovic, J. The cellular RNA helicase UAP56 is required for prevention of double-stranded RNA formation during influenza A virus infection. J Virol. 85, 8646-8655 (2011).
