Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen

Published: December 1, 2017 doi: 10.3791/54703
Automatic Translation
1,2, 2, 3, 3, 4
1Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Boston University, 2Biological Design Center, Boston University, 3Lattice Automation, 4Department of Electrical and Computer Engineering, Biological Design Center, Boston University

Summary

Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA "apparaat" vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.

Abstract

Recente vooruitgang in modulaire DNA vergadering technieken synthetische biologen te testen hebben ingeschakeld significant meer van de beschikbare "ontwerpruimte" vertegenwoordigd door 'apparaten' gemaakt als combinaties van individuele genetische componenten. Handmatige montage van dergelijke grote aantallen apparaten is echter tijdrovende vergissing-geneigd en kostbaar. De toenemende complexiteit en omvang van synthetische biologie onderzoek vereist een efficiënte, reproduceerbare manier aan grootschalige, complexe en hoge doorvoer apparaat bouw.

Hier, is een protocol van DNA vergadering met behulp van de Type-IIS-techniek voor het modulaire klonen (MoClo) van beperking endonuclease gebaseerd op twee vloeistof aangestuurde robotic platforms geautomatiseerd. Geautomatiseerde vloeistof-handling-robots vereisen zorgvuldige, vaak vervelend optimalisatie van pipetting parameters voor vloeistoffen van verschillende viscositeit (bijvoorbeeld enzymen, DNA, water, buffers), evenals de expliciete programmeren om juiste aspiratie en verstrekking van DNA onderdelen en reagentia. Dit maakt handmatige scriptschrijven voor complexe verzamelingen net zo problematisch als handmatige DNA vergadering, en vereist een softwaretool dat script generatie kunt automatiseren. Daartoe hebben we een web-gebaseerde softwaretool, http://mocloassembly.com, voor het genereren van combinatoriële DNA apparaatbibliotheken uit basisdelen DNA als Genbank bestanden geüpload. Wij bieden toegang tot het hulpprogramma, en een exportbestand van onze vloeibare handler software waarin geoptimaliseerd vloeibare klassen, labware parameters en dek lay-out. Alle gebruikte DNA-onderdelen zijn beschikbaar via Addgene, en hun digitale kaarten kunnen worden geraadpleegd via de Boston University BDC ICE register. Deze elementen vormen samen een basis voor andere organisaties om modulaire klonen experimenten en soortgelijke protocollen te automatiseren.

De geautomatiseerde DNA vergadering workflow hier gepresenteerd kan de productie van het herhaalbaar, geautomatiseerde, high-throughput DNA apparaten en vermindert het risico van menselijke fouten als gevolg van repetitieve handmatige pipetteren. Uit de gegevens blijkt de geautomatiseerde DNA vergadering reacties gegenereerd op basis van deze workflow ~ 95% correct zijn en vereisen weinig zo 4% als veel hands-on tijd sequencing, ten opzichte van handmatige reactie voorbereiding.

Introduction

De vroegste synthetische biologische genetische apparaten zoals de tuimelschakelaar Collins1 en de Elowitz repressilator2 aangetoond dat biologische systemen naar voren kunnen worden ontworpen om specifieke, deterministische functies. Sindsdien, hebben synthetische biologen gestreefd om levende systemen te verrichten geleidelijk meer complexe functionaliteit in de service van biomaterialen3, biotherapeutics4,5,6, biobrandstoffen ingenieur 7,8, en biosensing toepassingen9,10,11. Verwezenlijking van deze toepassingen door het combineren van modulaire DNA "delen" in "apparaten" met specifieke functionaliteit is een van de belangrijkste doelen van synthetische biologie. Voor dit proces moet worden geschaald, moet er een techniek waarmee de oprichting van complexe apparaten van grote bibliotheken van onderdelen in een tijd-efficiënte, kostenefficiënte, en het belangrijkst, reproduceerbare manier.

Zulk een expansieve assemblage proces is gerechtvaardigd, omdat momenteel het veld ontbreekt voor een compleet begrip van de regels begeleiden succesvol biologische systeem constructie en de samenstelling. Dit wordt verergerd door onvoldoende gekarakteriseerd DNA delen12, gebrek aan compatibiliteit en combineerbaarheid van delen13, en onverwachte, ongewenste interacties tussen genetische componenten binnen synthetische apparaten14, 15. bij gebrek aan betrouwbare voorspellende modellen, functionele synthetische genetische apparaten zijn aangekomen bij door trial and error, waarin wordt gevraagd om tientallen of zelfs honderden, input-output signaalsterkte varianten van een beoogde apparaat zijn gescreend en de "beste" is geselecteerd voor samenstelling met stroomafwaartse elementen16. Terwijl de moderne gestandaardiseerd DNA vergadering methoden zoals Golden Gate17en modulaire klonen maken18,19,20 dit proces gemakkelijker, een experimentele expert is nog steeds vereist voor het uitvoeren van elk protocol. Synthetische apparaten groeien in omvang en complexiteit, de totale beschikbare ontwerpruimte zal te groot geworden voor het bouwen en testen handmatig21, en het proces zullen ook ambachtelijke voor elke aanzienlijke vooruitgang die repliceerbaar worden gemaakt in het veld is.

Tot de komst van synthetische biologie en biologische deel repositories zoals de iGEM delen register (http://partsregistry.org), werden de JBEI voorraad van configureerbare elementen22en SynBioHub23, genetische delen niet opgeslagen in een de vergadering van de gestandaardiseerde indeling. Slechts een kleine handvol onderdelen moesten worden gekloond per project, en zo het volume van het klonen gedaan was klein, en de realisatie van een geassembleerd apparaat was haalbaar en triviaal vergeleken met de werkelijke onderzoekdoelstellingen. Moleculaire klonen was vaak ad hoc en uitgevoerd met behulp van restrictie digests gebaseerd op de site en endonuclease beschikbaarheid beperking in plaats van na afloop van een gestandaardiseerde proces. Het gebrek aan standaardisatie maakte het onpraktisch voor het automatiseren van alle klonen protocollen zoals het was onwaarschijnlijk dat de volgende klonen reactie een identieke protocol zou volgen. Bovendien, automatiseren DNA vergadering vereist aanzienlijke monetaire investeringen in apparatuur (vloeibaar behandeling van robots en de bijbehorende software en labware infrastructuur) alsook de tijdsinvestering voor de generatie van instructies om nauwkeurige parameters voor de behandeling van de verschillende klassen van vloeistoffen wordt verwerkt en de precieze reeks instructies voor het uitvoeren van deze protocollen. Kleinschalige klonen inspanningen deed geen rechtvaardiging voor deze kosten. De combinatie van grotere, meer complexe genetische apparaat ontwerpen in combinatie met de vergadering van de gestandaardiseerde protocollen24,25 creëert een omgeving waar de automatisering van deze processen zeer praktisch is. Low-cost robotica zoals de Opentrons OT-One26 zijn ook in opkomst waardoor zelfs bescheiden gefinancierde laboratoria voor toegang tot deze technologie. Bovendien, "cloud" laboratoria27 met inbegrip van Transcriptic, evenals Emerald Cloud Lab en academische "biofoundries" zoals de Edinburgh genoom Foundry, de UIUC iBioFab, en de MIT-brede Foundry, harnas robotica te monteren diverse sets met ontwerpen voor een verscheidenheid van klanten snel en herhaaldelijk terwijl het behoud van een gemeenschappelijke opslagplaats van fundamentele DNA primitieven en vergadering technologieën voor toekomstige orders.

Een van de grootste uitdagingen in het automatiseren van het proces van DNA vergadering is de generatie van de pipetting opdrachten voor de vloeibare-handler. Terwijl de interfaces van de software voor deze apparaten meestal makkelijk te gebruiken, complexe zijn vereisen pipetting instructies zoals die welke noodzakelijk zijn voor de combinatorische DNA vergadering de wetenschapper expliciet opgeven van elke aspirate en handmatig opdracht afzien. Dit maakt een grote knelpunt in de werkstroom, en laat het script generatie proces kwetsbaar voor dezelfde pipetting fouten als de vergadering handmatig werden uitgevoerd. Dit vereist een softwaretool dat alle delen van dit proces van het ontwerpen van de apparaatbibliotheek te genereren van de pipetting instructies, en de onderzoeker te voorzien van de plaat/reagens opstellingen moeten samenvoegen kunt automatiseren. In dit werk benutten we onze softwaretool voor het automatiseren van het ontwerp van een kleine combinatorische DNA apparaatbibliotheek, alsmede het mengen van de reagentia (buffer, water, enzymen) en delen van het DNA (Figuur 1b) in 96 één-pot modulaire DNA vergadering reacties. Gebruik van het hulpprogramma vereist geen voorafgaande programmeerervaring, is schaalbaar en hoge doorvoer, en combinatorische standaard. We laten zien dat klonen reacties bereid op twee verschillende geautomatiseerde liquid handling platformen opbrengst juiste volgorde-geverifieerd klonen met vergelijkbare frequentie reacties bereid handmatig (95%) en met aanzienlijk minder hands-on tijd.

Protocol

1. Geef delen moeten worden gebruikt voor DNA apparaatbibliotheek en genereren gebruiker/vloeistof Handler instructies [15 min]

  1. Met behulp van een webbrowser, ga naar mocloassembly.com en Genbank bestanden voor alle DNA-onderdelen die zal worden opgenomen in de combinatorische DNA apparaat ontwerp uploaden.
  2. Nadat alle bestanden zijn geüpload, selecteert u de gewenste delen van het DNA en sleep ze naar het lege doek, deel types in de beoogde uiteindelijke order van DNA delen plaatsen.
    Opmerking: Collecties van onderdelen, en ook afzonderlijke onderdelen, kunnen worden geselecteerd en geplaatst op het canvas. Ook DNA onderdelen te bestellen zodat de 5' en 3' overhangt voor elke wedstrijd deel.
  3. Klik op 'Assemble' op het bodemrecht van de pagina.
    Opmerking: Het hulpprogramma genereert alleen geldig, bebouwbare samenstellen op basis van de vier basenpaar overhangen die flank van elk onderdeel op de spijsvertering met het enzym BsaI. Als geen bebouwbare DNA-apparaten aanwezig is gebaseerd op de delen die zijn geüpload door de wetenschapper, zal de tool aangeven dat er geen vergaderingen zijn gevonden.
  4. Ga naar het tabblad 'Plannen' en downloaden van bestanden die zijn gegenereerd door het hulpprogramma. Deze bestanden omvatten:
    1. Leesbare plaat kaarten voor de wetenschapper te bereiden DNA-monsters, alsmede reagentia die nodig zijn voor de reacties
    2. Een 'selectielijst' voor de vloeibare-handler
    3. Volledig geannoteerde Genbank bestanden voor alle apparaten van DNA om te worden gemonteerd
      Opmerking: Liquid handling arm positionering bij het benaderen van eventuele nieuwe labware moet worden getest. Raadpleeg de handleiding van de fabrikant voor gedetailleerde instructies voor het aanpassen van de pipetting arm positionering in de X, Y en Z assen als dit nodig is.

2. voorbereiding van de plasmide DNA en reagentia voor montage [3 dagen]

  1. [Dag 1] Met behulp van een steriele inoculatie lus en werken in de buurt van een open vuur of in een laminaire flow hood, streak bacteriële glycerol voorraden op LB-agar platen aangevuld met de juiste antibioticum. Doe dit voor alle benodigde onderdelen van DNA, ervoor zorgend om de lus tussen elke sample steriliseren. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.
    Opmerking: Bevroren bacteriële glycerol voorraden moeten worden gehouden op het ijs zo veel mogelijk. Herhaalde bevriezen-ontdooien cycli verlagen de levensvatbaarheid van de voorraad en moeten worden vermeden.
  2. [Dag 2] Met behulp van een steriele pipette uiteinde, tandenstoker of inoculatie lus, en werken in de buurt van een open vuur of in een laminaire flow-kap, beënten 3 mL van de pond-Bouillon (aangevuld met de juiste antibioticum) met een enkele kolonie aan de platen van de LB-agar bereid in 2.1. Incubeer culturen 's nachts bij 37 ° C terwijl het schudden bij 300 omwentelingen per minuut.
  3. [Dag 3] Zuiveren plasmide DNA uit de bacteriële culturen met behulp van elke verkrijgbare mini prep kit voor de reiniging van de plasmide.
  4. Met behulp van het bestand MoClo_Setup.xlsx, Verdun elk monster van plasmide DNA tot een concentratie van 20 fmol/µL in water of TE buffer.
  5. Naar aanleiding van de kaart van de plaat van het PDF-bestand gegenereerd door het hulpprogramma van de vergadering, plaatst u de aangegeven hoeveelheid elk verdunde DNA-deel in de juiste goed op een full-skirted 96-Wells PCR plaat. Houd van dit SetupPlate op ijs totdat het nodig is, of verzegelen met een Zelfklevende zegel van folie en opgeslagen bij-20 ° C.
  6. Voorbereiden op het ijs, de reactie mastermix met de volgende onderdelen: voor elke 20 µL van reactie toevoegen 2 µL van 10 x T4 DNA ligase buffer 0.5 µL van T4 DNA Ligase (HC) en 1 µL van BsaI enzym. Een rekenmachine blad is opgenomen in het bestand MoClo_Setup.xlsx om te helpen met dit.
    1. Het enzym mastermix verdelen over de juiste putjes van een nieuwe full-skirted 96-Wells PCR plaat, na de plaat-kaart voor de ReagentPlate in het gegenereerde PDF-bestand. Houd deze ReagentPlate op ijs of op een 96-Wells koude-blok.
      Opmerking: De ReagentPlate moet alleen bereid zijn als u klaar bent om uit te voeren van de vergadering van de vloeibare-handler.

3. assemblage Script uitvoeren op de vloeibare Handler [variabele]

  1. Plaats de SetupPlate(s), de ReagentPlate(s) (op een 96-Wells-koude-blok) en het benodigde aantal lege volledige-skirted 96-Wells PCR-platen op het dek van de vloeibare handler. De lege plate(s) zullen de OutputPlate(s) waar de reacties worden geassembleerd.
  2. Voorbereiden van de vloeibare handler controle software door het creëren van exemplaren van elke plaat van het monster en reagens bereid, om ervoor te zorgen om hen te noemen, precies zoals ze worden weergegeven op de kaarten van de plaat gegenereerd door mocloassembly.com, met inbegrip van een trog van schone, gedeïoniseerd water met het label ' Reservoir'.
  3. Opdracht 'Composities' in de controle-software, laadt u het .gwl-bestand gegenereerd door onze softwaretool, gevolgd door een andere opdracht 'Oeuvrelijst' die het .gwl bestand geladen in de eerste opdracht zal uitvoeren.
  4. Het script met behulp van de opdracht van de controller-software 'Uitvoeren'.
    Opmerking: Altijd toestaan de robotic vloeibare handler te voltooien de uitvoering van een script voordat wordt geprobeerd toegang tot de ruimte van het dek.
  5. Verwijder alle platen uit het dek met vloeibare handler. Resterende DNA kan worden gered door het afdichten van de SetupPlate(s) met aluminium verzegeling film en opslaan bij-20 ° C. Zegel van de OutputPlate(s) met kleeffilm, plaats in een thermocycler of warmte-blok en uitvoeren met de volgende parameters van de cyclus:
    37 ° C gedurende 2 uur, 50 ° C gedurende 5 minuten, 80 ° C gedurende 10 min, houd bij 4 ° C
    Opmerking: Zodra de reactie thermocycling voltooid is, OutputPlate(s) kunnen worden opgeslagen bij-20 ° C tot ze klaar om te worden omgezet.

4. het transformeren van de reacties [1 dag]

  1. Ontdooien van het vereiste aantal bevoegde E. coli cel aliquots nodig (10 µL/reactie) op ijs.
    Opmerking: Om te handhaven steriliteit, de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in de buurt van een open vuur, of binnen in een laminar flow hood.
    1. Terwijl cellen zijn ontdooien, bereiden LB-agar platen (met juiste antibioticum) door pipetting 50 µL van 0,1 M IPTG en 50 µL van 20 mg/mL X-GAL op het oppervlak. Maak een master mix als een groot aantal reacties plating. Jas van de platen gelijkmatig met een steriel glasstaafje of glasparels en laat de platen rusten bij 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten voordat plating bacteriën.
      Opmerking: U kunt ook IPTG en X-Gal aan toevoegen vloeibare agar voordat platen worden gegoten, bij 2 mM IPTG en 40 µg/mL X-Gal eindconcentratie. Bewaar deze platen uit direct licht zoals X-Gal lichtgevoelig is.
  2. Op het ijs, aliquoot 10 µL van bevoegde cellen voor elke reactie in een nieuwe 96-Wells PCR plaat. Dit zal de transformatie-plaat.
  3. Voeg 1-3 µL van elke reactie uit de OutputPlate(s) met de corresponderende goed de transformatie-plaat en incubeer op ijs gedurende 5 minuten.
  4. Zegel van de transformatie plaat met zelfklevende film en warmte schok in een thermocycler bij 42 ° C gedurende 30 s. Dan, plaats onmiddellijk de plaat op het ijs gedurende 2 minuten.
  5. Aan de dezelfde putjes van de plaat van de transformatie, Voeg 150 µL van SOC media, verzegelen met een Zelfklevende zegel van aluminium en Incubeer bij 37 ° C terwijl het schudden bij 900 RPM voor 1 uur.
  6. De volledige inhoud van elk putje van de plaat van de transformatie op de platen van de LB-agar bereid in 4.1.1 met een steriel glasstaafje of glasparels gelijkmatig jas het oppervlak van de plaat plaat. Incubeer de platen bij 37 ° C's nachts.

5. kloon verificatie [2 dagen]

  1. Voorbereiden van één of meerdere 96-Wells diep-well cultuur blokken met 1,5 mL van de pond-Bouillon (met juiste antibioticum).
    1. Vergelijkbaar met de stap 2.2, enten van de diep-well cultuur scripttags met enkele witte kolonies van elke LB-agarplaat getransformeerde reacties.
    2. Verzegel de scripttags cultuur met een gas-permeabele zegel en na een nacht bebroeden bij 37 ° C terwijl het schudden van 900 toeren per minuut.
      Opmerking: De modular klonen techniek maakt gebruik van blauw-wit zeef, zodat positieve CFUs wit op de plaat van LB-agar, verschijnt terwijl de lege bestemming vectoren zal worden in blauw weergegeven.
  2. Isoleren van de plasmide DNA van bacteriële culturen (zoals in 2.3) en legt voor Sanger rangschikkend om te controleren of klonen.

Representative Results

Hier tonen we de geautomatiseerde modulaire vergadering van 96 DNA-apparaten van verschillende DNA basisdelen (Figuur 1b) met behulp van twee geautomatiseerde robot liquid handling platforms. Elke transcriptionele eenheid is een lineaire arrangement van de promotor, ribosomal bindende site, gene en transcriptionele terminator, gekloond in een vector van specifieke bestemming. TUs zijn een belangrijk onderdeel in veel hiërarchische genetische circuit ontwerpen28,29,30 en zijn daarom een natuurlijke proof of concept voor deze aanpak. Volgorde-geverifieerd klonen kunnen worden bereikt in de ~ 5 dagen van start tot finish, en een overzicht van de gepresenteerde workflow wordt gepresenteerd in Figuur 1a.

Met behulp van de beschreven hulpprogramma en het protocol, gevangen we diverse maatstelsels nuttig bij het bepalen van de optimale montage platform krijgt een bepaald aantal klonen reacties moeten worden gegenereerd door de wetenschapper. Figuur 2a toont een vergelijking tussen de reactietijden van de vergadering over alle drie modaliteiten. Uitvoering is de totale tijd aan alle pipetting stappen die nodig zijn voor het assembleren van 96 reacties, waaronder verstrekking van alle delen van het DNA en reagentia. Hands-on tijd verwijst naar de totale tijd die een mens was handmatig betrokken bij de voorbereiding van de klonen reacties of installatie van de software die wordt uitgevoerd van de vloeibare handler. Figuur 2b vergelijkt kosten tussen de verschillende methoden. Kosten gepresenteerd zijn voor een enkele reactie opgesteld door elke methode en de prijs van enzymen en wegwerp pipet tips, gezien de omvang van de laagste typische reactie omvatten (20 µL voor vloeibare handler, 10 µL voor handmatige, 250 nL voor akoestische dispenser). Enkele klonen van alle 96 Reacties voor zowel handmatige en vloeibare handler-bereid sets waren sequenced, met een subset van 12 sequenced voor de akoestische dispenser Reacties (Figuur 2 c). Juiste sequenties werden verkregen voor 95% van de 96 handmatige en vloeibare handler sets. 83% van de akoestische dispenser monster subset juist waren, maar de laatste twee reacties niet opbrengst elk witte kolonies, waarschijnlijk te wijten aan onvoldoende mengen van druppels na de aflevering van DNA en reagentia was compleet. Figuur 2d illustreert klonen reactie rendementen, gemeten door de verhouding tussen witte kolonies naar totale aantal koloniën, die vergelijkbaar zijn tussen handmatig (94%) en vloeibare handler geassembleerde (84%) reacties. Interessant is dat tijdens het schalen omlaag het volume van de uiteindelijke reactie met de akoestische dispenser, merkten we een duidelijke daling in reactie efficiëntie toen reacties waren voorbereid op volumes met minder dan 1 µL (aanvullende figuur 1 & aanvullende tabel 2). Dit is waarschijnlijk te wijten aan verdamping tijdens reactie thermocycling, die leiden een stijging van zout concentraties in de reactie tot kan.

Figure 1
Figuur 1. Geautomatiseerde DNA apparaat bibliotheek vergadering workflow.
(a) een overzicht van de experimentele workflow gepresenteerd in dit werk. (1) onderzoekers eerst Genbank bestanden uploaden om alle delen van het DNA & bestemming vectoren die zij wensen te gebruiken. (2) vervolgens zijn DNA delen moeten worden opgenomen in de vergadering geselecteerd. (3) het hulpprogramma genereert dan een selectielijst voor een geautomatiseerde vloeibare handler, evenals plaat kaarten om te helpen met handmatige bevolking met DNA delen en enzym mastermix. (4) het gebruikmaken van de DNA & reagentia platen, evenals de gegenereerde selectielijst, onderzoekers het uitvoeren van de vergadering van de klonen reacties op de vloeibare handler. (5) eenmaal voltooid, zijn de reacties omgezet en vergulde voor downstream-analyse. (b) lijst van DNA delen gebruikt in dit werk. Een totaal van drie initiatiefnemers hebben drie ribosomal bindend sites, vier codering sequenties, en één transcriptionele terminator werden gebruikt genereren de combinatorische bibliotheek van 96 TUs. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Vergelijkingen tussen drie verschillende reactie vergadering modaliteiten.
(a) reactie insteltijd voor 96 reacties gemonteerd handmatig, via een vloeibare handler, en door een akoestische dispenser. Handmatige vergadering nam 2 h 10 min, die allemaal hands-on tijd was. De vloeibare handler nam een vergelijkbare hoeveelheid tijd (2 h 6 min) uit te voeren van de pipetting opdrachten, maar slechts een fractie van die tijd (5 min) was hands-on. De akoestische dispenser nam aanzienlijk minder tijd uit te voeren van vloeibare overdracht (5 min) en nam van minimale hands-on tijd (5 min). (b) prijs per enkele klonen reactie voor elke vergadering-methode. Dit bedrag dekt de kosten van de enzymen worden gebruikt, evenals uiteinden van de pipet. (c) resultaten van enkele kolonies van alle 96 Sequencing TUs gemonteerd. Het percentage van de juiste klonen was vergelijkbaar over alle methoden van de vergadering. Merk op dat slechts een subset (12) van de volledige 96 assembly's van de akoestische dispenser bereid monsters werden omgevormd. Twee reacties niet opbrengst elk witte kolonies, waarschijnlijk als gevolg van onvoldoende mengen van DNA & enzym mastermix druppels in de OutputPlate. (d) vergelijking van het klonen van de efficiency van de reactie tussen handmatige en vloeibare handler-bereid reacties. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende figuur 1. Reactie efficiëntie vermindert met reactie volume verlagen.
Reactie efficiëntie dalen aanzienlijk wanneer schaalvergroting van reactie volumes onder 1 µL. Deze trend wordt gezien met twee verschillende DNA eindconcentraties; wetenschappers kunnen echter kiezen voor het gebruik van kleinere volumes om te besparen op de kosten van het reagens als lagere efficiëntie kunnen worden getolereerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 1.
Tabel van DNA en ENZYM vloeibare klasse parameters voor verschillende pipetting volumes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2.
De berekeningen van de efficiëntie van de reactie. Rauwe CFU nummers worden gegeven voor 12 van de 96 getransformeerde reacties bereid handmatig en via de vloeibare handler. CFU nummers zijn ook beschikbaar voor het testen van kleinere volumes van de definitieve reactie op de akoestische dispenser. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Kortom, de automatisering van de volledige DNA apparaat creatieproces, van in silico ontwerp tot liquid handling, is een haalbaar doel met het momenteel bestaande technologie. Software en moderne robotica maken het van werkstromen die zijn kosten-efficiënte, tijd-efficiënte en schaalbare, terwijl ook het produceren van meer consequent reproduceerbare resultaten dan handmatige methoden. Hoewel automatisering misschien niet altijd de voordeligste keuze voor de uitvoering van een protocol, het verbetert experimentele reproduceerbaarheid en bevrijdt omhoog waardevolle onderzoeker tijd. Echter, afhankelijk van de hardware gebruikt, het gebruik van automatisering kan soms rijden kosten en uitvoeringstijd ver beneden wat kan worden bereikt door middel van conventionele handmatige methoden. Anderzijds automatisering vangt protocollen expliciet in een geformaliseerde manier voorkomen ad hoc, ambachtelijke, en anekdotische beste praktijken op basis van experimenten. Hier de geautomatiseerde vergadering van modulaire apparaten van DNA wordt aangetoond, en het protocol, elektronische bestanden, en fysieke middelen van DNA die nodig zijn voor de lezer om te voeren deze en soortgelijke experimenten op hun eigen worden meegeleverd. We hopen dat de beschikbaarheid van onze tool, en de publicatie van dit protocol zal dienen als een hulpbron en verplaats het veld naar een meer transparante en gemeenschappelijke toekomst op het gebied van DNA assemblage processen en de vloeistof verwerken robotica.

Het nut van automatisering hardware is grotendeels afhankelijk van de configuratie & mogelijkheden van die hardware. Bijvoorbeeld, onze vloeibare handler gebruikt systeem vloeistof verplaatsing actuate aspirate en afzien van opdrachten. De zuigers dat station de vloeistof systeem zijn relatief grote 1 mL spuiten die, terwijl nuttig voor een aantal volumes, legt een ondergrens van 2 µL voor nauwkeurige verstrekking van reagentia. Dientengevolge, wij opgeschaald naar het totale volume van het klonen van de reacties die zijn ingesteld op de vloeibare handler 20 µL, omdat elke opdracht moest worden ≥2 µL afzien. Dit verdubbeld effectief de kosten per reactie voor vloeibare handler-klaargestoomd reacties, maar de hoeveelheid hands-on tijd die nodig is om uit te voeren die reacties werd aanzienlijk teruggebracht. In een poging om dit probleem te verhelpen, herhaald wij de reactie setup voor alle 96 Reacties op een akoestische vloeistof dispenser. Dit apparaat maakt gebruik van geluid energie af te zien van vloeistof rechtstreeks uit één plaat naar de andere, en kunnen afzien van de volumes ver onder (2.5 nL) wat is mogelijk met standaard lucht verplaatsing gebaseerd handmatige pipetten. Het gebruik van dit apparaat, konden we aan het verkleinen van het totale volume van onze reacties op 250 nL, een 40-fold lager ligt dan handmatig bereid reacties van 10 µL. Vanwege de kleine volumes achterwege gelaten, en het ontbreken van tip veranderingen tussen pipetting stappen, de akoestische dispenser was in staat om het genereren van de dezelfde 96 reacties in een fractie van de tijd (< 5 min). De kleinere volumes van de reactie ook opslaan op verspilde reagentia, omdat doorgaans alleen we 1-3 µL van de reactie transformeren. Dat gezegd zijnde, kunt het gebruik van automatisering hardware, in combinatie met intuïtieve software, de generatie van grote aantallen DNA vergadering reacties toegankelijk maken voor een veel breder publiek van de academische.

We laten hier zien het nut van onze softwaretool, maar er zijn een aantal functies die zou helpen het nut ervan te verbreden. Eerst, telkens wanneer die het hulpprogramma wordt gebruikt voor het genereren van een combinatorische assemblage, nieuwe DNA deel platen moeten worden gegenereerd, waarbij de wetenschapper handmatig vullen deze platen voor elke vergadering worden uitgevoerd. Het zou daarentegen nuttig zijn als de wetenschapper kon Geef de locatie van onderdelen in een DNA-plaat om te worden gebruikt in de vergadering. Hierdoor zouden het gebruik van high-throughput plasmide DNA reiniging kits aangezien onderzoekers kon culturen uit een kit zoals de CIDAR MoClo-bibliotheek beënten, en te zuiveren van alle monsters samen met behoud van de goed locatie van elk onderdeel dat is opgegeven in de kit. Ten tweede, het hulpprogramma ondersteunt momenteel alleen het gebruik van 96-wells-platen. Voor grotere projecten waar verschillende honderd DNA-apparaten moeten worden gebouwd, kan het aantal DNA, reagens en bestemming platen de dek-capaciteit van de vloeibare handler overschrijden. Dit probleem kon worden, ten minste gedeeltelijk, verlicht door ondersteuning voor hogere dichtheid plaat formaten (384 of 1536-well). Ten slotte het hulpprogramma ondersteunt momenteel alleen een enkel type van vloeibare handler en DNA vergadering strategie. Hoewel het is relatief gemakkelijk de hulpprogramma-geproduceerde vloeibare handler instructies omzetten in een akoestische dispenser-formaat met behulp van spreadsheet-software, hopen we uit te breiden native ondersteuning aan vele verschillende vloeibare handlers die sterk de toepasbaarheid ervan, als verruimen zou wil de compatibiliteit met andere gemeenschappelijke vergadering technieken van DNA Gibson vergadering31.

Een cruciaal onderdeel van deze geautomatiseerde montage-ecosysteem is een set softwaretools die op hoog niveau vergadering plannen automatisering vriendelijke protocollen die expliciet zijn gepland vertaalt te lopen op vloeistof verwerken van robots. Hoewel een aantal softwaretools bestaan waarmee onderzoekers te ontwerpen van assembly's in silico met inbegrip van Benchling, MoClo Planner en Raven32, hebben weinigen de mogelijkheid om deze ontwerpen te vertalen in uitvoerbare instructies uit te voeren op een vloeistof handler. Dat einde, werken zoals PR-PR automatisering en poppenspeler33,34,35 zijn begonnen deze hulpmiddelen ter beschikking te stellen. Commerciële organisaties werken in dit gebied bekijkt voorts manieren om "wolk labs" experimentele diensten aan grote groepen van eindgebruikers via automatisering verlenen. Het protocol beschreven in dit document kan dienen als een stuk van om het even welk van deze inspanningen bedoeld dat ze worden gepresenteerd als een service.

Terwijl geautomatiseerde samenstel van DNA voorzieningen van onmiddellijke en duidelijke waarde aan synthetische biologie is, is ons protocol handig voor de grotere Gemeenschap van moleculaire biologen ook. Automatiseren van DNA vergadering staat grote aantallen van bekende, maar soortgelijke, genetische apparaten gemaakt in parallel en kan inschakelen de snelle synthese van expressie bibliotheken voor screening en testdoeleinden in ontwikkelingsstudies van de drug. Wij hopen dat onze softwaretool zal grotere combinatorische gebaseerde DNA vergadering inspanningen toegankelijker te maken, en als een nuttige bron voor zowel de synthetische biologie, evenals grotere academische gemeenschap dienen.

Disclosures

Densmore is de President en mede-oprichter van Lattice automatisering, Inc. Timmons en McCarthy zijn Lattice medewerkers. Rooster maakt software en diensten voor de automatisering van veel van het proces beschreven.

Acknowledgments

Wij danken Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez en Johnson Lam voor werk op de poppenspeler project, evenals Swati Carr, Rachael Smith en Thomas Costa voor hulp met dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NSF carrière Award #1253856. Het wordt ook gefinancierd door de NSF expedities in Computing Award #1522074.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hardware / Software
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot Tecan Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm
http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) Tecan Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware
Echo 550 Labcyte Acoustic Liquid Dispenser
http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler
Sorvall Legend RT Sorvall Large benchtop swing-bucket sentrifuge
MasterCycler Pro Eppendorf 950040015 Thermocycler with 96-well heat block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath Torrey Pines Scientific Heating/Chilling block for EVO 150 deck
https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr
Tabletop Microcentrifuge 5418 Eppendorf 5418000017 Stardard 18-well microcentrifuge
https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418--5418R-PF-9257.html
Name Company Catalog Number Comments
Resources
mocloassembly.com Lattice Automation Web-tool for combinatorial DNA assembly
mocloassembly.com
CIDAR MoClo Parts Kit AddGene 1000000059 Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study
https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/
CIDAR ICE Registry CIDAR Lab Registry of plasmid DNA maps
https://ice.cidarlab.org/folders/8
https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current
Name Company Catalog Number Comments
Labware
50 μL Conductive Tips Tecan 30 057 818 Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler
http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips
2 mL Deep 96-well Culture Plates USA Scinetific 5678-0285 Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples
http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html
1.5 mL Microcentrifuge Tubes USA Scinetific 1615-5599 Disposable microcentrifuge tubes
http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx
Breathe Easier sealing membrane Sigma-Aldrich Z763624-100EA Breathable sealing membrane for bacterial culture plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en&region=US
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates GeneMate T-3183-2 PCR plates used for all steps
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates GeneMate T-2451-1 Alluminum seals for PCR plate storage
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates GeneMate T-2450-1 Plastic seals for PCR plates during cycling
https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1
PCR Cooler Eppendorf 22510525 96-well cold block
https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit Epoch Life Sciences 2160250 Plasmid DNA purification kit
http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx
T4 DNA Ligase (HC) Promega M1794 High concentration T4 DNA Ligase
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794
BbsI Restriction Enzyme New England Biolabs R0539L BbsI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r0539-bbsi
BsaI Restriction Enzyme New England Biolabs R0535L BsaI enzyme at 10,000 units/ml
https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf
T4 DNA Ligase Buffer Pack Promega C1263 10x T4 DNA ligase buffer
https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Zymo Research I1001-25 0.5M IPTG Solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) Zymo Research X1001-25 20 mg/ml X-GAL solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal
Kanamycin Sulfate Zymo Research A1003-25 35 mg/ml Kanamycin solution
http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate
Carbenicillin (Disodium Salt) Fisher BP26481 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog)
https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin
SOC Broth Media Teknova S0225 Powder media used to make SOC broth
http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm
LB Broth (Lennox) Media Sigma-Aldrich L3022-1KG Powder media used to make LB broth
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en&region=US
LB Broth with agar (Lennox) Media Sigma-Aldrich L2897-1KG LB with agar mix used for making solid media plates
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en&region=US
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells Bioline BIO-85027 High efficiency chemically competent E. coli cells
http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html
Name Company Catalog Number Comments
Primers
Primer VF 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs
Primer VR 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3'
Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403 (6767), 339-342 (2000).
  2. Elowitz, M. B., Leibler, S. A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature. 403 (6767), 335-338 (2000).
  3. Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nat Biotechnol. 23 (1), 47-55 (2005).
  4. Anderson, J. C., Clarke, E. J., Arkin, A. P., Voigt, C. A. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J Mol Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
  5. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  6. Ro, D. K., et al. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature. 440 (7086), 940-943 (2006).
  7. Georgianna, D. R., Mayfield, S. P. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. 488 (7411), 329-335 (2012).
  8. Savage, D. F., Way, J., Silver, P. A. Defossiling fuel: how synthetic biology can transform biofuel production. ACS Chem Biol. 3 (1), 13-16 (2008).
  9. Fussenegger, M., et al. Streptogramin-based gene regulation systems for mammalian cells. Nat Biotechnol. 18 (11), 1203-1208 (2000).
  10. Boorsma, M., et al. A temperature-regulated replicon-based DNA expression system. Nat Biotechnol. 18 (4), 429-432 (2000).
  11. Malphettes, L., et al. A novel mammalian expression system derived from components coordinating nicotine degradation in arthrobacter nicotinovorans pAO1. Nucleic Acids Res. 33 (12), e107 (2005).
  12. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nat Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  13. Lou, C., Stanton, B., Chen, Y. J., Munsky, B., Voigt, C. A. Ribozyme-based insulator parts buffer synthetic circuits from genetic context. Nat Biotechnol. , (2012).
  14. Cardinale, S., Arkin, A. P. Contextualizing context for synthetic biology--identifying causes of failure of synthetic biological systems. Biotechnol J. 7 (7), 856-866 (2012).
  15. Carr, S. B., Beal, J., Densmore, D. M. Reducing DNA context dependence in bacterial promoters. PLoS One. 12 (4), e0176013 (2017).
  16. Yeung, E., Ng, A., Kim, J., Sun, Z. Z., Murray, R. M. Decision and Control (CDC), 2014 IEEE 53rd Annual Conference on. , 5405-5412 (2014).
  17. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), e5553 (2009).
  18. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. PLoS One. 6 (2), e16765 (2011).
  19. Iverson, S. V., Haddock, T. L., Beal, J., Densmore, D. M. CIDAR MoClo: Improved MoClo Assembly Standard and New E. coli Part Library Enable Rapid Combinatorial Design for Synthetic and Traditional Biology. ACS Synth Biol. 5 (1), 99-103 (2016).
  20. Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).
  21. Bhatia, S. P., Smanski, M., Voigt, C. A., Densmore, D. M. Genetic design via combinatorial constraint specification. ACS Synth Biol. , (2017).
  22. Ham, T. S., et al. Design, implementation and practice of JBEI-ICE: an open source biological part registry platform and tools. Nucleic Acids Res. 40 (18), e141 (2012).
  23. Madsen, C., et al. The SBOL Stack: A Platform for Storing, Publishing, and Sharing Synthetic Biology Designs. ACS Synth Biol. 5 (6), 487-497 (2016).
  24. Knight, T. Draft standard for BioBrick biological parts. , (2007).
  25. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  26. Ma, A. C., et al. FusX: A Rapid One-Step Transcription Activator-Like Effector Assembly System for Genome Science. Hum Gene Ther. 27 (6), 451-463 (2016).
  27. Check Hayden, E. The automated lab. Nature. 516 (7529), 131-132 (2014).
  28. Nielsen, A. A., et al. Genetic circuit design automation. Science. 352 (6281), aac7341 (2016).
  29. Woodruff, L. B. A., et al. Registry in a tube: multiplexed pools of retrievable parts for genetic design space exploration. Nucleic Acids Res. 45 (3), 1553-1565 (2017).
  30. Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
  31. Gibson, D. G. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 498, 349-361 (2011).
  32. Appleton, E., Tao, J., Haddock, T., Densmore, D. Interactive assembly algorithms for molecular cloning. Nat Methods. 11 (6), 657-662 (2014).
  33. Vasilev, V., Liu, C., Haddock, T., Bhatia, S., Adler, A., Yaman, F., Beal, J., Babb, J., Weiss, R., Densmore, D. A Software Stack for Specification and Robotic Execution of Protocols for Synthetic Biological Engineering. SynBERC Fall Retreat, Harvard University. , (2011).
  34. Beal, J., et al. An end-to-end workflow for engineering of biological networks from high-level specifications. ACS Synth Biol. 1 (8), 317-331 (2012).
  35. Bhatia, S., Densmore, D. Pigeon: a design visualizer for synthetic biology. ACS Synth Biol. 2 (6), 348-350 (2013).

Tags

Bioengineering kwestie 130 synthetische biologie geautomatiseerde liquid handling Robotica modulaire klonen geautomatiseerde DNA vergadering combinatorische bibliotheek assemblage biofoundry
Geautomatiseerde robot Liquid Handling samenstel van modulaire DNA voorzieningen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L.,… More

Ortiz, L., Pavan, M., McCarthy, L., Timmons, J., Densmore, D. M. Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices. J. Vis. Exp. (130), e54703, doi:10.3791/54703 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter