सरल और कुशल उत्पादन और माउस Myelin Oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन की शुद्धि प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis अध्ययन के लिए
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
एमएस एक मानव रोग जीर्ण सूजन और सीएनएस जो एक autoimmune प्रतिक्रिया माइलिन की ओर निर्देशित द्वारा संचालित होने लगा है की neurodegeneration के द्वारा होती है। समय के साथ माइलिन और एक्सोन के नुकसान संज्ञानात्मक और मोटर समारोह 1 की क्रमिक गिरावट में परिणाम। "प्रायोगिक ऑटोइम्यून Encephalomyelitis" सीएनएस माइलिन की ओर निर्देशित autoimmune रोग के पशु मॉडल के लिए एक छाता शब्द है। मानव एमएस की तरह, EAE आम तौर पर कुछ मामलों में सीएनएस की प्रतिरक्षा सेल घुसपैठ की विशेषता है और, माइलिन रहित 2। हालांकि, डिग्री है जो किसी भी EAE मॉडल हिस्से में जैसा दिखता है मानव एमएस प्रजाति या तनाव का इस्तेमाल किया पर और अंतर्निहित विरोधी माइलिन autoimmune प्रतिक्रिया की जटिलता पर निर्भर करता है।
एंटी माइलिन औतोइम्मुिनित प्रयोगात्मक कई मायनों में प्रेरित किया जा सकता है, लेकिन आज सबसे आम विधि का इस्तेमाल किया immunodominant सीडी 4 नकल उतार अमीनो एसिड की एक छोटी पेप्टाइड के साथ चूहों का टीकाकरण करने के लिए है <sऊपर एक माइलिन प्रोटीन की> + टी सेल मिलान। यह एक रोगजनक प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए न्यूनतम आवश्यकता प्रतिनिधित्व करता है। शायद इनमें से सबसे आम एक 21 एमिनो एसिड पेप्टाइड (MOG 35-55) माइलिन oligodendrocyte ग्लाइकोप्रोटीन से प्राप्त होता है, जो C57BL / 6 चूहों 3 में EAE प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, कुछ प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए यह बड़ा प्रोटीन एंटीजन और वास्तव में वहाँ छोटे पेप्टाइड के साथ टीकाकरण पर इस के लिए कई फायदे हैं साथ टीकाकरण के लिए वांछनीय या भी आवश्यक है। सबसे पहले, एमएचसी प्रतिबंध के कारण, लघु पेप्टाइड्स आमतौर पर स्ट्रेन के एक बहुत ही सीमित दायरे में ही प्रभावी रहे हैं, जबकि बड़े प्रोटीन या तो पूरी प्रोटीन या एक विशिष्ट डोमेन का प्रतिनिधित्व एंटीजन विभिन्न प्रजातियों में कई जन्मजात माउस उपभेदों में प्रस्तुति के लिए सामान्य रूप से कार्रवाई की जा सकती है या भी 4। दूसरा, एक बड़ा प्रोटीन प्रतिजन एक अधिक जटिल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, लिम्फोसाइट से अधिक प्रकार को शामिल प्रतिजन मान्यता में उत्प्रेरण के बजाय limitin करने में सक्षम हैसीडी 4+ टी कोशिकाओं को जी प्रतिजन मान्यता। उदाहरण के लिए, उनके बी सेल रिसेप्टर (बीसीआर) के माध्यम से बी कोशिकाओं पूरे बजाय संसाधित प्रोटीन के साथ सीधे बातचीत। हम और दूसरों है कि बी कोशिकाओं MOG 35-55 टीकाकरण से सक्रिय MOG प्रोटीन 5 पहचान नहीं दिखाई है। बी कोशिकाओं हाल ही में मानव एमएस 6 में एक रोगजनक भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया के बाद से, EAE मॉडल है कि स्व-प्रतिरक्षित विकृति में बी कोशिकाओं को शामिल तेजी से महत्वपूर्ण हैं।
EAE प्रेरित करने के लिए बड़ा प्रोटीन एंटीजन उपयोग कर के लाभ के बावजूद, वहाँ इस तरह के प्रोटीन के लिए कुछ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध स्रोतों रहते हैं। दरअसल, जबकि MOG 35-55 की तरह कम पेप्टाइड्स बहुत जल्दी और एक अपेक्षाकृत कम लागत पर संश्लेषित किया जा सकता, MOG प्रोटीन के लिए वाणिज्यिक विकल्प सीमित है और लागत काफी अधिक खरीद करने के लिए कर रहे हैं। फिर भी, वहाँ कई अभिव्यक्ति MOG बाह्य डोमेन उत्पन्न करने के लिए अनुसंधान समूहों के लिए उपलब्ध वैक्टर (MOG 1-125) स्वयं कर रहे हैं। Howeveआर, अभिव्यक्ति प्रणाली है कि हम साहित्य में पहचान की है के सभी पुराने प्रौद्योगिकियों कि जब से अधिक कुशल अभिव्यक्ति सिस्टम 7 के साथ प्रतिस्थापित किया गया है पर आधारित हैं। इसके अलावा, सबसे चूहे या मानव MOG 8 पर आधारित हैं। चूहों में autoimmunity के कुछ जांच के लिए, माउस MOG स्वप्रतिजन के आधार पर एक प्रतिजन बेहतर है। अंत में, सभी MOG आधारित प्रोटीन है कि हम पहचान की है, या तो वाणिज्यिक या अभिव्यक्ति वैक्टर के रूप में, फ्यूजन MOG 1-125 आधार करने के लिए अतिरिक्त अमीनो एसिड से युक्त प्रोटीन होते हैं। इन के रूप में अच्छी शुद्धि और आमतौर पर अन्य दृश्यों के लिए एक टैग है, जो एक समारोह के साथ के कई हम पहचान करने में असमर्थ थे शामिल हैं।
इन सीमाओं को संबोधित करने के लिए, हम माउस MOG बाह्य डोमेन thioredoxin युक्त प्रोटीन MOG 5 के नाम से जाना जाता जटिलता से निपटने के लिए एक टैग के लिए जुड़े हुए पर आधारित एक उपन्यास संलयन प्रोटीन उत्पन्न। टैग अनुक्रम भी शुद्धि और एक TEV प्रोटीज CLE के लिए एक 6xHis अनुक्रम में शामिलavage साइट अगर वांछित कि, सभी टैग दृश्यों का पूरी तरह हटाने के लिए अनुमति देता है। यह एकमात्र तरीका है कि हम शुद्ध MOG 1-125 प्रोटीन उत्पन्न करने के बारे में पता कर रहे हैं। प्रोटीन की अधिक मात्रा के उत्पादन को सुविधाजनक बनाने के लिए, MOG 1-125 अनुक्रम बैक्टीरियल अभिव्यक्ति के लिए कोडोन अनुकूलित किया गया था और MOG टैग संलयन प्रोटीन पीईटी-32 अभिव्यक्ति प्रणाली में डाला गया था। यहाँ, हम प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन उत्पादन और शुद्ध MOG टैग प्रोटीन, और शुद्ध MOG 1-125, गैर विशेष उपकरणों की सबसे इम्यूनोलॉजी प्रयोगशालाओं के लिए उपलब्ध का उपयोग कर।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम MOG टैग प्रोटीन और कैसे MOG टैग प्रोटीन से शुद्ध MOG 1-125 उत्पन्न करने के उत्पादन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया है। इस प्रोटोकॉल मानक उनकी टैग आधारित प्रोटीन शुद्धि के तरीकों, साथ ही एक ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
References
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