ゼブラフィッシュは、食事の脂質処理と代謝性疾患の貴重なモデルとして浮上しています。脂質が豊富な幼虫の飼料のプロトコル、食事性蛍光脂質類似体のライブイメージング、および食物摂取量の定量化について説明します。これらの手法は、さまざまなスクリーニング、イメージング、および仮説主導の調査手法に適用できます。
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この記事について
サマリー
要約
ゼブラフィッシュは、食事の脂質処理と代謝性疾患のモデルとして浮上しています。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼生に脂質が豊富な食事を与える方法を説明しています。これは、卵黄を胚培地で超音波処理することによって作成された鶏卵黄リポソームのエマルジョンで構成されています。卵黄の消費について幼虫をスクリーニングするための詳細な指示が提供されており、摂食に失敗した幼虫が実験結果を混乱させないようにします。鶏卵黄リポソームには、脂肪酸やコレステロールなどの蛍光脂質類似体を添加することができ、食事性脂質処理の全身的および細胞内的な可視化が可能になります。幼虫をマウントするためのいくつかの方法が説明されており、高倍率と低倍率で直立対物レンズと倒立対物レンズの両方を使用した短期および長期のライブイメージングに役立ちます。さらに、蛍光脂質類似体を与えられた幼虫の脂質を抽出し、薄層クロマトグラフィープレート上の脂質を見つけ、蛍光を定量化することにより、幼虫の食物摂取量を定量化するアッセイも提示されます。最後に、手順の重要な側面、重要な制御、特定の実験上の問題に対処するためのプロトコルの変更オプション、および潜在的な制限について説明します。これらの技術は、焦点を絞った仮説主導の調査だけでなく、食事性脂質代謝や食物摂取の制御を研究するためのさまざまなスクリーニングやライブイメージング技術にも適用できます。
概要
腸は食物脂質の処理を調節する機構は、肝臓は、複合脂質の合成およびリポタンパク質代謝を制御し、これらの器官は、食物摂取量を制御するために、中枢神経系でどのように機能するか完全には理解されています。これは、肥満、心臓血管疾患、糖尿病、および非アルコール性脂肪肝疾患の現在の流行に照らして、この生物学を解明するために、生物医学的関心です。細胞培養およびマウスにおける研究食物中の脂肪と病気の間の機械的な関係の理解の大部分を提供している、およびゼブラフィッシュ（ ゼブラフィッシュ）は、この作業を補完する理想的なモデルとして浮上しています。
ゼブラフィッシュは、急速に発展、高等脊椎動物1,2と同様の胃腸（GI）器官、脂質代謝、およびリポタンパク質の輸送があり、遺伝的に扱いやすいです。幼虫のゼブラフィッシュの光学的透明性は、in vivo試験で particulaを容易にGI系の研究のためのRの利点その細胞外環境（ すなわち 、胆汁、微生物、内分泌シグナリングは）ex vivoでのモデル化することは事実上不可能であるように。とゼブラフィッシュ幼生のイメージングを生きるために、遺伝的扱いやすさとconducivenessを組み合わせた研究によれば、体食物の操作（高脂肪3,4、 -コレステロール5、および-....
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プロトコル
これらのプロトコルは、科学施設内動物管理使用委員会のためのカーネギー研究所（プロトコル番号139）によって承認されています。
1.動物の準備
- 10時間明：暗サイクル14時間で28℃で大人と幼虫を維持します。シェル無料アルテミア （デカプセル化、非ハッチング、14 DPFで開始）と商用マイクロペレット1日2回大人フィード。
- これらのプロトコルは、ABの背景の自然産卵により収集6-7 DPFの幼虫の使用に最適化されています。プロトコルは、他の年齢や背景の幼虫のために改変することができます。前6 DPFに外因性の食べ物を提供しないでください。
- （ミリリットルは、EMは100あたり4 mg / mlでトリカインの4.2ミリリットル）を室温（RT）で胚のメディア（EM）にトリカインで幼虫を麻酔します。
脂質の豊富な卵黄フィードの調製
- 鶏の卵黄を準備し、格納します。 12鶏卵の卵黄と白を分離します。 1.5に卵黄、アリコート1ミリリットルをプールmlチューブ、および1年のCまで-80℃で保存してください（12黄身は〜80アリコートを行います）。白人のプール、店舗、および脂質に乏しい、タンパク質が豊富な飼料として使用します。
- 所望であれば、卵黄飼料に添加される蛍光脂質類似体（複数可）を準備します。
- 製造元の指示に従って、不透明なガラス管....
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結果
29-31℃でロッカーに供給すると、健康な幼虫（≥95％）の大半は、1時間以内に食べるようになります。卵黄エマルジョンを消費すると、幼虫の腸は、カラーで暗くなります。非常に暗い腸2時間（ 図1）で観察することができます。幼虫が未吸血されているか、または供給するために失敗した場合、腸は透明なまま。幼虫供給卵白展示色で暗くしない膨張した腸管腔。
図1：食物摂取のための幼虫のスクリーニング野生型6 DPFの幼虫は2時間EMに5％の卵黄を供給または食物を与えられていないコントロールを得るために、EMで平行して処理しました。ステレオスコープの10Xで撮像時に卵黄を消費した給餌幼虫が暗い腸を持っていながら未吸血幼虫は明確な腸を持っています。スケールバーは、0.1ミリメートルを表しています。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをク.......
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ディスカッション
ここに記載された技術は、研究者は、脂質の豊富な飼料と幼虫のゼブラフィッシュを扱うライブ幼虫に食餌脂質処理を可視化し、幼虫の食物摂取量を定量化することができます。成功を確実にするために、特別な注意は、いくつかの重要なステップに与えられるべきです。コマーシャル鶏の卵は異なります。潜在的な変動を最小限に抑えるために、我々は、オメガ3脂肪酸について濃縮されていないケージフリー鶏から有機卵のすべてのアッセイを行います。下側の供給速度は、より若い6食物摂取（ すなわち 、顎または腸奇形、適切に泳ぐことができないことを）妨げる発達変異を有する内因性卵黄エネルギー供給、不健康な魚、または魚を残りとDPF魚で観察することができます。それらの内因性卵黄店が排出されると卵黄の枯渇は、消化器系のより良い可視化を可能にするまで、幼虫は外因性の食べ物を必要としないため、ファーバー研究室では、一般的に6〜7日後に受精（DPF）で供給した研究を行います。給餌RTでも大幅に食べる幼虫の数を減らすことができます。食物摂取とその後の実験で未吸血幼虫が意図せずに含めるための幼虫のスクリーニングに失敗すると、結果を混乱させることがあります。加えて、最大蛍光、し.......
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開示事項
著者らは開示するものは何もない。
謝辞
著者は、画像を提供してくださったMeng-Chieh Shenさん、原稿に有益なコメントを提供してくださったJennifer Andersonさん、そしてこれらの技術の開発に貢献してくださったFarber研究室のメンバーに感謝します。本研究は、NIDDK-NIH award RO1DK093399 (S.A.F.)、RO1GM63904 (The Zebrafish Functional Genomics Consortium: PI Stephen Ekker and Co-PI S.A.F.)、および F32DK096786 (J.P.O.) の資金提供を受けました。このコンテンツは著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を表すものではありません。G・ハロルド・アンド・レイラ・Y・マザーズ慈善財団は、S.A.F.の研究所とカーネギー科学研究所の寄付に対して、追加の支援を提供しました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| トリカイン(エチル3-アミノ安息香酸メタンスルロフネート塩) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | ゼブラフィッシュの幼虫用麻酔 |
| 鶏の卵 | N/A | N/A | フリー卵、omege-3脂肪酸に濃縮されていない |
| 超音波プロセッサ3000 sonicator | Misonix、Inc. | S-3000 | 卵黄リポソームを作るために |
| Sonabox 音響エンクロージャ | 株式会社ミソニックス | 432B | 卵黄リポソームを作るには |
| 1/8" テーパード マイクロチップ | Misonix, Inc. | 419 | 卵黄リポソームを作るには |
| 琥珀色のバイアル (4 ml、ガラス) | National Scientific | 13-425 | 脂質貯蔵; バイアル、オープントップ キャップ、キャップ セプタム |
| インキュ シェイカー ミニ | ベンチマーク | 1222U12 | 用インキュベートシェーカーBODIPY |
| FL C16 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | D3821 | 蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ヘキサデカン酸) |
| ボディピーFL C12 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | D3822 | 蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ドデカン酸) |
| ボディピーFL C5 | サーモフィッシャーサイエンティフィック | D3834 | 蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ペンタン酸) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | 蛍光脂質アナログ;(4,4-ジフルオロ-5,7-ジメチル-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-プロピオン酸) |
| TopFluorコレステロール | アバンティポーラーリピッド株式会社 | 810255 | 蛍光脂質アナログ; 23-(ジピロメテンボロン二フッ化物)-24-ノルコレステロール |
| 脂肪酸フリー BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | TopFluor コレステロール可溶化用 |
| メチルセルロース | Sigma-Aldrich | M0387 | 生きた幼虫イメージング用封入剤; 75 x 25 x 1 mm |
| 低融点アガロー | サーモフィッシャーサイエンティフィック | BP165-25 | 生きた幼虫用封入剤イメージング;22 x 30 |
| VWR顕微鏡スライド | VWR | 16004-422 | ライブイメージング用幼虫の装着 |
| カバースリップ | カバーガラス | 12-544A | ライブイメージング用幼虫取付 |
| スーパーグルー | ロックタイト | LOC01-30379 | ライブイメージング用取付幼虫 |
| FluoroDish(ガラス底皿) | ワールド・プレシジョンズ(株) | FD35-100 | ライブイメージング用埋込幼虫 35mmディッシュ、23mmガラス、0.17mmガラス厚 |
| 共焦点顕微鏡 | ライカマイクロシステムズ | SP-2, SP-5 | 高倍率ライブイメージング用顕微鏡 |
| ステレオスコープ | ニコン | SM21500 | 低倍率ライブイメージング用 |
| 顕微鏡 ガラス製培養チューブ | キンブル | 73500-13100 | 脂質抽出;(13 x 100 mm; 13 ml) |
| サバントSpeedVacプラス | ThermoQuest | SC210A | 脂質抽出 |
| チャネリング TLC プレート | Whatman Scientific | WC4855-821 | 食物摂取アッセイ;LK5D シリカゲル 150 A、20 x 20 cm、厚さ 250 um。販売終了 |
| チャネリングTLCプレート | Analtech, Inc. | 66911 | 食物摂取アッセイ;Whatman Scientific TLCプレートの直接交換 |
| Typhoon 9410 可変モードイメージャー | GE Healthcare | 9410 | 食品摂取アッセイ用蛍光プレートリーダー |
| ImageQuantソフトウェア | GE Healthcare | 29000605 | 食品摂取アッセイの分析 |
| 5 3/4'ワイドボア、ホウケイ酸ディスポーザブルパスツールピペット | キンブル | 63A53WT | 転送幼虫 |
参考文献
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501(2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M. Plasma lipoproteins in fish. J Lipid Res. 30 (4), 467-489 (1989).
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