Burada üçüncü instar (L3) Drosophila melanogaster larva evresi içinde organizma yağ seviyelerini ölçmek için bir yöntem mevcut. Bu yöntem, değişmiş yağ mağazaları ile larva ayırt etmek için yağ dokusunun nispeten düşük yoğunluğa patlatır. Yüzdürme-tabanlı analiz, hızlı, tekrarlanabilir ve ekonomik tarama için değerli bir araçtır.
Drosophila melanogaster is a key experimental system in the study of fat regulation. Numerous techniques currently exist to measure levels of stored fat in Drosophila, but most are expensive and/or laborious and have clear limitations. Here, we present a method to quickly and cheaply determine organismal fat levels in L3 Drosophila larvae. The technique relies on the differences in density between fat and lean tissues and allows for rapid detection of fat and lean phenotypes. We have verified the accuracy of this method by comparison to body fat percentage as determined by neutral lipid extraction and gas chromatography coupled with mass spectrometry (GCMS). We furthermore outline detailed protocols for the collection and synchronization of larvae as well as relevant experimental recipes. The technique presented below overcomes the major shortcomings in the most widely used lipid quantitation methods and provides a powerful way to quickly and sensitively screen L3 larvae for fat regulation phenotypes while maintaining the integrity of the larvae. This assay has wide applications for the study of metabolism and fat regulation using Drosophila.
Drosophila melanogaster genetik ve diğer temel biyolojik soruların çalışmada bir yüzyılı aşkın süredir kullanılmaktadır. Drosophila birçok insan hastalıklarının çalışmada güçlü bir araç olduğunu son birkaç on yıl içinde, bu netlik kazanmıştır. İnsan hastalıklarıyla bağlantılı genlerin% 80 bir tanımlanmış uçucu ortologu 1 etmek – – 70 de 4, Drosophila kompleks hastalıkların çalışma için basitleştirilmiş yapılmamış çevrilebilir bir sistem sağlar. Özellikle Metabolizma böyle çalışmaya yararlanmıştır. Sadece iyi uçar ve insanlar arasında korunmuş metabolizmanın genetik olarak, ama ilgili organ ve hücre tipleri, aynı zamanda 2,5 çok benzerdir. Örneğin, memeli karaciğer ve beyaz yağ dokusunda 6 yapılanlar hem triasilgliseridler (TAG) ve glikojen, fonksiyonlar benzer sinek mağazaların vücut yağ. Insan obezite için bir model olarak Drosophila kullanarak büyük ölçüde lipit anlayışımızı geliştirdimetabolizma ve obezite 7 genetiği. gelişme larva bu besleme adanmış ve enerji depolama pupariation sırasında kullanılmak üzere depolama veya kullanım besin ayrılmasını çalışmak için özellikle yararlıdır.
Şu anda, Drosophila yağ depolama düzeylerinin belirlenmesi birçok farklı sayısal yöntemler vardır. En yaygın olarak kullanılan yöntem birleştiğinde kolorimetrik (CCA) 8,9 olduğunu. CCA İnsan serumundaki TAG düzeylerinin belirlenmesi için geliştirilmiş ve sonunda renkli bir ürün üreten bir redoks-bağlanmış reaksiyonda elde edilen çeşitli reaksiyonlara tabi olacak trigliseritlerin omurgasından serbest gliserol öncül faaliyet göstermektedir. ışığının belirli dalga boyu Absorbans, gliserol mevcut başlangıç miktarını belirlemek için ölçülür. Bununla birlikte, gliserol da TAG ilave olarak mono- ve diasilgliseridler serbest bırakılabilir ve bu nedenle, S doğru bir göstergesi olabilirizlenmekte vücut yağ 9. Ayrıca, ezilmiş yetişkin sineklerin göz pigmenti bazı absorbans okumaları müdahale ve sonuçları 9,10 karmaşık hale getirebilir. Bu nedenle, CCA eşlik yoğunluk 10,11 nicelendirilebilir en lipit ailelerinin ayrılmasını sağlar, ince tabaka kromatografisi (TLC) ile doğrulanması gerekir. Ancak, steroller gibi bazı lipit sınıfları analiz edilemez ve farklı bir şekilde 12 sayısal olmalıdır. Kütle spektrometrisi (MS) önemli hücresel lipidlerin 12,13 bütün sınıfları ölçmek için doğru bir yöntemdir. Ancak, MS tarafından analiz için gerekli lipid çıkarma prosedürleri hem zaman alıcı (çoğu almayı neredeyse bir tam gün) ve yüksek maliyetlidir. Burada hızlı ve ucuza Drosophila melanogaster L3 larvaları organizma yağ düzeylerini belirlemek için alternatif bir yöntem mevcut.
Aşağıda sunulan yöntem yağ dokusu ve yağsız doku arasındaki yoğunluk farkı patlatır. memeli faT hücre 1.06 g / ml, 15 yoğunluğunda olarak, yaklaşık 0.9 g / ml 14 ise, iskelet kası bir yoğunluğa sahiptir. Bu fark, yağ yüksek mağaza hayvanlar onları sabit yoğunluklu bir çözelti içinde daha iyi bir yüzer sağlayacak yağ alt mağazalar, hayvanların daha düşük bir yoğunluğa sahip olacağı anlamına gelir. Bu özellik, pahalı olmayan ve invazif olmayan hem de olan Hayvanların büyük sayıda son derece hızlı taranması için izin verir. Yüzdürme tabanlı analiz yanı sıra obezitenin 16,17 yeni genetik ve nörolojik düzenleyiciler tanımlamak için yağ seviyelerinin bilinen düzenleyicileri değiştiren fenotipleri onaylamak için ikisi de kullanılır olmuştur.
10 – lipit düzeyleri 8 ölçmek için geliştirilmiş olan teknikler çok sayıda bulunmaktadır. Ancak, bu yöntemlerin her biri yukarıda özetlenen yüzdürme-bazlı deney ile ele bazı önemli dezavantajları ile birlikte geliyor. İlk olarak, bu deney, son derece hızlıdır. 60 dk – tam bir konsantrasyon gradyanı test fazla 30 sürer. Bu, şu anda kullanılmakta olan tekniklerin en çok büyük bir gelişmedir. bunları analiz etmek lipidler ve başka birkaç saat izole etmek iç…
The authors have nothing to disclose.
K.E.H. was supported by the Training Grant in Molecular Biology NIH-T32-GM08730. This work was supported by NIH, NIDDK Grant 5K01DK095932 and AHA Award 12BGIA11930014 to T.R.
Bacto Agar | VWR | 214030 | |
Welch's Original 100% Grape Juice | |||
Sucrose | Fisher | S512 | |
Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | |
Ethanol | 200 proof | ||
Baker's yeast | Fleichmann's | ||
Yellow Corn Meal | Quaker | Enriched degerminated | |
Drosophila Agar Type II | Apex | 66-104 | |
Soy Flour | ADM Specialty Ingredients | 062-100 | |
Malt Extract | Breiss | 5748 | |
Light Corn Syrup | Karo | ||
Propionic Acid | VWR | U330-09 | |
Sodium chloride | Fisher | 50147491 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655-100G | |
Sodium phosphate anhydrous | Fisher | S3933 | |
Potassium chloride | Fisher | P330-500 | |
35 x 10mm petri plate | Fisher | 08-757-100A | |
50mL Conical | Fisher | 50-869-569 |