Rollen sortiment (romlig atskillelse) i evolusjonære scenarier kan bli undersøkt ved hjelp av enkle mikrobielle systemer i laboratoriet som tillater kontrollert justering av romlig fordeling. Ved å endre grunnlegger celletetthet, kan ulike sortiment nivåer visualiseres ved hjelp av fluorescensmerkede bakteriestammer i koloni biofilm av Bacillus subtilis.
Microbes provide an intriguing system to study social interaction among individuals within a population. The short generation times and relatively simple genetic modification procedures of microbes facilitate the development of the sociomicrobiology field. To assess the fitness of certain microbial species, selected strains or their genetically modified derivatives within one population, can be fluorescently labelled and tracked using microscopy adapted with appropriate fluorescence filters. Expanding colonies of diverse microbial species on agar media can be used to monitor the spatial distribution of cells producing distinctive fluorescent proteins.
Here, we present a detailed protocol for the use of green- and red-fluorescent protein producing bacterial strains to follow spatial arrangement during surface colonization, including flagellum-driven community movement (swarming), exopolysaccharide- and hydrophobin-dependent growth mediated spreading (sliding), and complex colony biofilm formation. Non-domesticated isolates of the Gram-positive bacterium, Bacillus subtilis can be utilized to scrutinize certain surface spreading traits and their effect on two-dimensional distribution on the agar-solidified medium. By altering the number of cells used to initiate colony biofilms, the assortment levels can be varied on a continuous scale. Time-lapse fluorescent microscopy can be used to witness the interaction between different phenotypes and genotypes at a certain assortment level and to determine the relative success of either.
I de siste tiårene har mikrober blitt anerkjent som sosiale fellesskap forbundet med ulike økosystemer på jorden 1,2. I motsetning til planktoniske kulturer brukes generelt laboratoriepraksis, mikrober i miljøet viser et variert utvalg av romlige samfunnsstrukturer avhengig av den økologiske innstilling. Enkle mikrobielle systemer kan anvendes for å forstå konsekvensen av romlige strukturer på utviklingen av sosial interaksjon 3,4. Publikasjoner i de siste 2-3 årene med både eukaryote og prokaryote modellsystemer fremhevet betydningen av romlige strukturer på stabiliteten av samarbeidet i mikrobielle populasjoner 5-8. I tillegg er obligate interaksjoner mellom mikrober, f.eks metabolsk kryssforing, kan også endre den romlige fordelingen av samvirkende partnere 9-11. Påvirkningen av romlige strukturen i disse studiene er stort sett undersøkt ved hjelp av overflate festet fastsittende celler som befolker såalarmert biofilm eller i kolonier som vokser på overflaten av et agarmedium. Genetisk drift resulterer i høy romlig utvalg kan observeres i mikrobielle kolonier hvor næringsutarming i kanten av en celledeling mediert utvidelse av resultatene i serie med genetiske flaskehalser som fører til høy lokal fiksering sannsynlighet for visse klonale linages 12. Genetisk drift kan derfor brukes til å undersøke hvilken rolle romlig segregering i mikrobielle kolonier.
I miljøet, biofilmer er flerbestands samfunn omgitt av egenprodusert polymermatriks 13. Biofilm struktur, funksjon og stabilitet er avhengig av et komplekst nettverk av sosiale interaksjoner hvor bakterier utveksle signaler, matrisekomponenter og ressurser, eller konkurrere om plass og næringsstoffer som bruker giftstoffer og antibiotika. Bacillus subtilis er en jord bolig og rot-koloniser bakterie som utvikler svært organisert biofilmsamfunn 14. I analogi til sosialinsekter, B. subtilis celler ansette en arbeidsdeling strategi, utvikle subpopulasjoner av ekstracellulære matrix produsenter og kannibaler, bevegelige celler, sovende sporer og andre celletyper 15,16. Differensieringsprosessen er dynamisk og kan endres av miljøforhold 17,18.
Strategier for overflate kolonisering av bakterier kan lett manipuleres under laboratorieforhold ved å endre agar konsentrasjonen i vekstmediet. Ved lave agar nivåer (0,2-0,3%), bakterier huser aktiv flag er i stand til å svømme, mens halvfast agar (0,7-1% agar) letter flagellen drevet samfunnet sprer seg, heter svermende 19-21. I fravær av flagellen, visse bakteriestammer er i stand til å bevege seg over halvfast medium via skyve, dvs. vekst avhengige befolkning utvidelse lettes ved exopolysaccharide matrise og andre utskilte hydrophobin forbindelser 22-24. Endelig bakterier som er capable av biofilm utvikling skjema arkitektonisk komplekse kolonier på hardt agar medium (1,2-2%) 14,17,25. Mens disse trekkene er undersøkt i laboratoriet ved nettopp å justere betingelsene, i naturlige habitater disse overflatespredning strategier kanskje transitt gradvis fra ett til et annet, avhengig av miljøforholdene 26. Mens enkelt celle basert motilitet er kritisk under initiering av biofilm utvikling ved luft-væske-grensesnittet i både Gram-positive og -negative bakterier 27, komplekse koloni biofilm av B. subtilis blir ikke påvirket av sletting av flagellar motilitet 28. Men romlige organiseringen under utviklingen av B. subtilis koloni biofilmer avhenger av tettheten av bakteriepodestoff anvendes for å initiere biofilmen 8.
Her bruker vi B. subtilis for å vise at romlig segregering under overflaten koloniseringen er avhengig av mekanismen for populasjonsnivå motility (dvs. krydde eller skyve), og kolonien biofilm utvikling avhenger av grunnleggeren celletetthet. Vi presenterer et fluorescerende mikroskopi verktøy som kan brukes til kontinuerlig å overvåke mikrobiell biofilm vekst, overflate kolonisering og sortiment på makroskala. Videre er en kvantifisering fremgangsmåte presentert for å bestemme den relative belastning overflod i befolkningen.
Tilgjengeligheten av et fluoriserende verktøykasse for bakterier letter ikke bare studiet av heterogene genekspresjon 30,31 og protein lokalisering 32, men også analyse av romlige fordelingen av belastninger innen en populasjon 8. Fluorescent markører med tilstrekkelig forskjellige eksitasjon og emisjonsbølgelengder tillate å tydelig lokalisere to stammer som ellers er umulig å skille fra hverandre når de blandes. Den beskrevne protokollen kan være ansatt for å observere populasjonsdynamikken i blandede kulturer, for eksempel konkurranse eksperimenter eller synergi mellom stammer eller arter. Muligheten til å bestemme de relative Forekomsten av fluorescensmerkede stammer i en blandet populasjon er ikke begrenset til overflaten festet sverm, skyvedører, eller biofilm kolonier, men kan også brukes til andre flercellede biofilmsystemer, inkludert nedsenket, strømmer celle eller luft-medium grensesnitt biofilmer 27,33-35.
_content "> Mens present teknikken er et kraftig verktøy for å oppdage romlig fordeling av stammer og designkonkurransen eksperimenter, er det også mulig å følge genuttrykk heterogenitet i voksende kolonier. De dyrkingsforholdene er beskrevet her, gjelder for B. subtilis og de nøyaktige parametere for utvidelse på agar materiale krever optimalisering for andre arter eller stammer 20. Plassering prøvene i en inkubasjon kammer mens bildebehandling tillater eksperimentator å følge populasjonsdynamikk i tid, selv om oppmerksomhet bør gis til fuktighetsnivået i kammeret under inkubasjon.Teknikkene som er beskrevet her krever også den genetiske modifikasjon av de undersøkte bakteriestammer, slik at stammene uttrykker fluorescerende markører som kan skilles fra hverandre. Videre har, foruten å ha distinkte eksitasjon og emisjonsspektra, anbefales det at de to valgte fluorescerende markørene har lik Quantum gir (dvs. forholdet mellom absorberte fotoner som slippes ut) og kommer til uttrykk i et tilsvarende nivå. I tillegg kan relative intensitetsendringer i tid bli målt og normalisert til en tidlig tids punkt av et eksperiment. Den relative økningen eller reduksjonen kan deretter sammenlignes mellom ulike fluorophores med ulike kvante effektivitet. For den presenterte eksperimentelle systemet, ble ulike drivhus og rød-fluorescerende proteiner testet tidligere 36,37 for å velge de mest optimale fluorescerende parene som kan oppdages i B. subtilis. Den optimale eksponeringstiden bør bestemmes for hver fluorescerende protein og prøve. Visse celletettheter eller flere lag av celler som kan være nødvendig for å detektere signalet effektivt inne i populasjonen. Visse fluorescerende proteiner kan ha lave intensiteter i bakteriecellene på grunn av ineffektiv ekspresjon og / eller translasjon av proteinet og således lavt kvanteutbytte. Slike ineffektive fluorescerende markører kan reduce følsomheten av systemet og forlenge den tid som trengs for å detektere de bakteriestammer som muligens resulterer i cytotoksisitet av eksitasjonslyset. De fluoriserende intensiteter kan følgelig modifiseres ved å forandre promoter anvendt for å uttrykke den kodende fluorescerende rapportørgenet. Et uttrykk nivå som er for høyt kan resultere i unødvendig overproduksjon av det fluorescerende protein som fører til skadelige egnethet kostnader for bakterien. Ved utførelse av konkurrerende eksperimenter, bør man ta hensyn til kostnaden av denne fluorescerende protein produksjon i cellene. Kontroll eksperimenter, hvor de fluorescerende markørene er byttet mellom konkurrerte stammer eller hvor to isogene stammer ulike bare i sine fluorescerende markører konkurrerte mot hverandre, er alltid nødvendig for å fastslå noen skjevhet mot en markør. Levetiden på de fluorescerende proteiner i cellene kan også påvirke målt intensitet. I tillegg autofluorescens av visse bakterie species kan kreve bruk av ulike andre enn beskrevet her fluorescerende markører.
Å bestemme nøyaktig den romlige fordelinger og Forekomsten av forskjellige bakteriestammer, må bakgrunnssignal som kommer fra den første fluorescerende protein ved bruk av fluorescens filter for den andre fluoriserende fargestoff og vice versa være individuelt testet på monokultur prøver (inneholdende bakterier som produserer bare en markør ). Dette gjør at subtraksjon av overlappende fluorescerende signalintensiteter. Viktigere, som stereomikroskopet registrerer fluorescens-signalet fra ovenfor det ekspanderende kolonien, er det presentert protokollen praktisk å bestemme den romlige anordning i to dimensjoner. Arkitekturen av ekspanderende bakteriell befolkningen kan føre til varierende fluorescens nivåer (dvs. rynke-lignende strukturer kan inneholde flere celler som viser høyere lokal fluorescensstyrkene). Derfor er den beskrevne analyse av bildene determines den romlige distribusjon, men ikke overflod av stammene innenfor et bestemt sted. Tidligere protokoller beskrev prøveopparbeidelse for svermende 20 eller fluorescens avbildning av populasjonsdynamikk i bakteriekolonier 38, men vår protokoll kombinerer disse teknikkene. Andre mikroskopi teknikker som tillater observasjon av tredimensjonale oppløsning av befolkningsstruktur (f.eks konfokal laser scanning mikros 39,40 eller strukturert belysning mikros 41) kan brukes for prøver med økte strukturelle kompleksiteten. Disse flere teknikker støtter også enkelt celle basert påvisning av stammene 31 som ikke er tilgjengelig ved hjelp stereomicroscopes.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av stipend KO4741 / 3-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Videre ble laboratoriet av Á.TK støttet av en Marie Skłodowska Curie karriere integreringstilskuddet (PheHetBacBiofilm) og gi KO4741 / 2-1 fra DFG. TH, AD, RG-M., Og EM ble støttet av internasjonale Max Planck forskerskole, Alexander von Humboldt fundament, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología-tyske Academic Exchange Service (CONACyT-DAAD), og JSMC laug, henholdsvis.
Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
KCl | any | NA | |
MgSO4 7H2O | any | NA | |
Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
MnCl24H2O | any | NA | |
FeSO4 | any | NA | |
D-Glucose | any | NA | |
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d=66 mm |
Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1000 mm |
Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3mm x 2000mm |
Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63x |
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
Softwares | |||
Image J | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |