Summary
動脈裸出損傷後の再内皮の細胞および分子メカニズムを理解することは、動脈の血栓症および再狭窄を予防する上で極めて重要です。ここでは、下腹部大動脈の再現性動脈裸出損傷のためのプロトコルについて説明します。手順は、マウスモデルを使用して、内皮の再生を制御する機序を研究するために開発されました。
Abstract
経皮的血管インターベンションを均一に続いて血栓症および再狭窄につながる動脈削剥傷害につながります。これらの合併症は、創傷縁内に再内皮に障害に起因することができます。しかし、再内皮の細胞および分子メカニズムが定義されていません。動脈裸出後の再内皮化を研究するためのいくつかの動物モデルが利用可能であるが、いくつかはあるため、外科的制限のマウスで行われています。これは、トランスジェニックマウス系統を利用し、再内皮の処理に特定の遺伝子の寄与を調査する機会を損ないます。ここでは、外部血管クランプを使用して、下腹部大動脈に動脈裸出損傷の再現性の高いマウスモデルを作成するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。フィブリノゲンおよびβカテニンのため負傷した大動脈の免疫細胞化学染色はプロ血栓性表面ANの暴露を実証しますそれぞれ、無傷の内皮の境界線をdは。ここに提示された方法は、トランスジェニックマウスモデルにおける動脈裸出傷害を課すための一意の実用的なツールを作成する、速度、優れた全体的な生存率、および相対技術的容易さの利点を有します。この方法を使用して、研究者は、正常または病的な条件下での再内皮化のメカニズムを解明することができます。
Introduction
血栓症および再狭窄は、血管内バルーン血管形成術及び1,2-ステント留置などの経皮的血管介入を受ける患者に深刻な初期および後期合併症です。いくつかの戦略は、特に、二重抗血小板療法と薬物溶出ステントをこれらの合併症に対処するために使用されています。しかし、少しの焦点は、血栓症および再狭窄、内皮細胞のカバレッジ(削剥)の、すなわち損失の根本的な原因に置かれています。裸出傷害は、血管壁への機械的外傷による介入手順の必然的な結果です。この機械的外傷、血液3循環の損傷および基底膜および血管平滑筋の保護内皮層と露光の除去をもたらすことができます。これらの分野での内皮細胞の損失は、血小板接着およびその後の血栓症を促進するだけでなく、プロ血栓性および前炎症性環境を作成しますLSOは、新生内膜肥厚及び再狭窄4で得られた血管平滑筋細胞の遊走および増殖を刺激します。これらの合併症、およびそれらに関連する治療法は、人間の健康に影響を与える重要な罹患率、最も顕著な再発虚血性疾患や出血事象につながります。
再内皮創傷縁から剥皮損傷の血栓症および再狭窄5を予防する上で極めて重要です。ステントのカバレッジが6,7支柱と剖検結果および動物モデルは、効果的に血栓症の縮小率を示しました。薬剤溶出ステントは、動脈の再内皮化および後期血栓3の増加率に有意な障害をもたらし、平滑筋の増殖および新生内膜過形成を抑制することにより再狭窄率を減少させるために考案。残念ながら、再内皮ためのメカニズムを理解することは、主にAPの不足によって制限され、ゆっくりとしたプロセスとなっていますpropriate動物モデル8。
動脈損傷後の内皮細胞および血管平滑筋細胞の役割を理解するためのいくつかの動物モデルは、7,9,10が作成されています。ラット頸動脈バルーン傷害モデルは、最高の特徴であると、細胞および分子レベル11、肉眼で裸出傷害の影響を研究するために使用されています。それにもかかわらず、優れた生存率と動脈裸出損傷の再現性の高いマウスモデルは、不足しているとはるかに優れた複数の設定の血管再生を解明するために利用可能な複数のトランスジェニック系統を利用するために必要とされています。
この原稿は、再現性があり、実行するのは簡単である動脈裸出損傷のマウスモデルを提示します。アプローチは、いくつかのトランスジェニック系統において最小の罹患率および死亡率を示しました。なぜなら遺伝的に改変されたマウス系統の広範な数の、このモデルに使用することができます削剥傷害後の再内皮化の根底にある分子メカニズムを解明。
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Protocol
注:このプロトコルは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で動物研究委員会によって承認されています。
1.術前の準備と麻酔
- 作業中の滅菌技術を必ず守ってください。
- 蒸気オートクレーブを使用して、すべての手術用消耗品を滅菌します。
- それは、外科手術中に可視化するために実体顕微鏡下で適切な温度(37℃)の場所に温めることができるように前に麻酔導入に加熱された齧歯類の外科のプラットフォームをオンにします。
- 麻酔誘導チャンバ内にマウスを置き、1リットル/分の流速で4%イソフルランで誘導します。
- 慎重に誘導時のマウスの呼吸数およびフットパッド肌の色を監視します。
- 呼吸速度の減速した後、誘導チャンバーからマウスを削除し、2.5%の独立したノーズコーンとメンテナンスイソフルラン濃度の顔をした外科手術の準備のために温めたパッドの上に置きます。
- 麻酔薬の妥当性を評価するためにつま先のピンチを実行します。
- 角膜に眼軟膏を適用し、(5ミリグラム/ kg)を皮下術前カルプロフェンを投与します。
- 腹部から毛を除去するために、マウス仰臥位および使用バリカンを置きます。
- 滅菌ガーゼパッドで適用される3ポビドンヨードの交互スクラブと70%イソプロピルアルコールで手術領域を準備します。
- ノーズコーン内の顔をして加熱齧歯類の外科のプラットフォームの上に置いてマウスの仰臥位とすべての四肢を固定し、慎重に腹部を実体顕微鏡で見えるようにマウスを置きます。
- 準備された手術領域の各辺に沿って、滅菌、接着剤包帯を置きます。
- 自発呼吸を維持しながら、手術中に十分な麻酔を維持するために、イソフルラン濃度を滴定します。
2.腎臓下の大動脈クランプ
- approximatelを開始、メスを用いて腹部の正中線の下3センチメートル切開を作ります剣状突起に劣るyの0.5センチメートル。
- 優しく鉗子で皮膚を撤回し、微細な結合組織を切断するために微細なハサミを使用して腹壁から肌を分析。
- 筋肉壁に0.5%ブピバカイン0.05〜0.1 mlで適用し、腹部臓器を露出するために腹壁に2cmの切開を行います。
- 出血が腹壁に沿って発生した場合は、綿棒で穏やかな圧力を適用します。
- 静かに生理食塩水に浸した綿棒のアプリケーターを使用して腸を持ち上げます。
注:腹腔外に暖かい、滅菌生理食塩水に浸したガーゼスポンジで空腸と回腸動脈と場所への鈍的外傷を避けるように注意してください。- 水分損失を回避するために別の暖かい、滅菌生理食塩水に浸したガーゼスポンジで腸をカバーしています。
- 直腸をlateralizeし、後腹膜を露出させるために開創器を置きます。
- retroperitoneの可視化のため、必要に応じて小さなガーゼパッドを配置umの使用数を追跡します。
- 右腎の下極のレベルでは、大動脈への横retroperitonotomyを作るために、鋭い解剖鉗子を使用しています。
注:下大静脈や周囲の血管を傷つけないように注意してください。- ぶっきらぼうに大動脈から後腹膜組織を解剖 下大静脈や周囲の血管系を穿孔しないように注意してください。
- 少なくとも1分間、大動脈、または他の指定された時間をかけて血管クランプを配置し、視覚的に遠位大動脈における拍動性の欠如を観察することにより閉塞を確認します。
- 血管クランプを外し、止血を確認します。止血を達成し、血液のアクティブな血管外漏出が見られないときに確保されています。
- 腹腔内に0.5ミリリットルの生理食塩水を添加し、生理食塩水がますます血を帯びたになると評価することによって、血管外漏出を確認します。このような場合は、保証するために、1分間生理食塩水に浸したアプリケーターを用いて穏やかな圧力をかけます止血。
- 後腹膜の可視化に役立つと腹部にその場で腸を置き換えるために置かれたガーゼパッドを取り外します。
- 予め温めた滅菌生理食塩水を使用して腹腔を灌漑。
開腹し、皮膚の3閉鎖
- 5-0編組、吸収性単ランニング縫合糸を使用して腹壁筋層を閉じます。
- 1-3ポリマー接着剤の滴、その後創傷クリップを有する接着剤がセットされた後との緊密な肌。
4.回復と術後評価
- ケージの床に食料と水を加熱パッド上で回復ケージにマウスを転送します。
- 密接に呼吸困難の徴候についてマウスを監視します。機関のガイドラインあたり術後48時間毎日カルプロフェン(5 mgの/キログラム)を管理します。
- それは胸骨recumを維持するのに十分な意識を取り戻したまで無人の動物を放置しないでくださいbency。
- 食料と水と通常のケージにマウスを返します。
- 完全に回復するまで、他の動物の会社に手術を受けた動物を返さないでください。
- 裂開のための日常的に傷を評価し、術後14日目に、クリップを取り外してください。
5.大動脈解離と染色
- 裸出損傷後の関心のある特定の時点に基づいて、犠牲のためのマウスを選択します。
- イソフルラン吸入によりマウスを屠殺し、直ちに血管平滑筋弛緩を引き起こすことは5mgのメタコリン塩化注入。
- 呼吸停止、角膜反射および運動の欠如の欠如により死亡が確認されると、10分、左心室を経由して100 mmHgでの灌流圧でリン酸緩衝生理食塩水で4%パラホルムアルデヒドで灌流。
- 注意深くから無傷の腹部大動脈を分離するために解剖実体顕微鏡を使用して、周囲の組織。
- 腸骨分岐に腎動脈と尾側に大動脈吻側を横断し、背側表面に沿って縦切開を介して開かれました。
- 無未満2時間までの固定のための管腔側と35ミリメートルシリコーンコートディッシュ以上は必要ない12時間に平らに大動脈をピン。その後、組織はどちらの切片用に包埋または顔全体マウント免疫細胞化学専用に使用することができます。
- 共焦点顕微鏡用ガラススライド上のカバーガラスに面した腔側で染色した大動脈をマウントします。
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Representative Results
八十-5マウスは、下腹部大動脈クランプのために、このレポートに記載され生存手術法を受けています。全体的な生存率は85.9%でした。手術合併症は、腸の出血および大血管穿孔、5.9%および3.5%の死亡率が得られた( 表1)に含まれます。麻酔から回復した後、マウスは正常に歩くと下肢に虚血損傷の兆候を示しません。体重減少または食欲の欠如は認められませんでした。
(A)がなく、(B)、大動脈のクランプを持つ実体顕微鏡下で開腹し、後腹膜切開次の下腹部大動脈の図1Aおよび1Bは、画像。示されるように、大動脈の幅に沿って削剥を確実にするために、その全体が大動脈の幅をクランプするために重要です。私たちのプロトコルは、急カーブシュワルツマイクロセレを使用していることがわかっ1.75ミリメートルの顎幅の罰金と '強い'クランププレスは、最小限のクランプ時間で大動脈の幅全体の最大連続傷を生産しました。しかしながら、他のクランプ可変損傷のサイズ( 図1C)を有するいくつかの閉塞時間間隔で試験しました。提示された結果の残りの部分は、上記クランプを用いて製造しました。
大動脈の組織学的評価は、H&E染色によって示されるように、基礎となる平滑筋細胞層に適度なダメージと内皮層の完全な削剥を示しています。内皮の裸出は異なる程度( 図2)にあるが、10秒および10分の両方で起こります。完全な動脈裸出に必要な最適な大動脈クランプ時間間隔を決定するために、マウスは、10秒、1分、10分間クランプ受け、上記のプロトコールに記載されるように、直ちに分析のために屠殺しました。アール侵食の増加クランプタイミング( 図3)と増加しました。 10秒、約0.75ミリメートル2の不完全および斑状削剥負傷でフィブリノゲンが裸出損傷のためのマーカーとして役立つ斑状フィブリノゲン染色によって同定されました。大動脈クランプの10分は、しかし、クランプのこの時間量は、四肢虚血および再灌流障害のリスクが高いと考えられた、約1.2ミリメートル2の完全剥皮内皮面積を生産しました。このように、我々は、虚血性傷害の証拠なしでほぼ完全に動脈削剥傷害をもたらすために、平均して侵食の0.88ミリメートル2の面積を生産し、十分な大動脈クランプの1分とみなします。
大動脈クランプの1分で裸出損傷の程度は、600μmの直径と裸出( 図3および4)の0.88ミリメートル2の面積を生産、非常に再現性があります。ザフィブリノゲン染色の強度は、後の時点で、元の損傷を識別するのに十分である。 図4は高度に再現性の傷害を作成、屠殺前24時間クランプ大動脈の1分を受けた3匹のマウスのフィブリノゲン染色を示します。 6大動脈の損傷後のフィブリノゲン染色24時間の測定は、約0.81ミリメートル2( 図5A)、0.88ミリメートル2傷害と統計的に類似した直後に負傷した(p = 0.14)の後に注目されます。無傷の内皮細胞と比較すると、裸出損傷( 図5B)に再内皮を、フィブリノゲン染色を覆うマーキングと内皮細胞の移行傷害ショー後の傷のマージン24時間。平均で0.88 mm 2の裸出傷害の完全な再内皮化は、約3日を要した。しかし、このアプローチは、さらにより大きな侵食損傷を生成するように適合させることができます。それぞれ、複数回のクランプ1分間、頭側からの腎臓下の大動脈に沿って尾側に3.7ミリメートル2削剥損傷を生じました。このアプローチはまた、損害賠償中膜が、我々は、クランプ損傷の結果として、腹部大動脈の解剖を観察したことがありません。
このプロトコルは、下腹部大動脈クランプ安全動脈裸出傷害の作成および内皮再生を測定する目的のためのマウスモデルにおいて行うことができることを示しています。
図1:下腹部大動脈単離された単離された下腹部大動脈(A)なしに血管クランプ(B)で示されています。種々の長さ及びクランプ押圧強度のいくつかのクランプは、一貫した損傷(C)を提供する 1つを選択するために使用しました。シュワルツマイクroの止血小鉗子(矢印)は、最大連続傷を生産した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2:非損傷マウスで下腹部大動脈節(A)の内皮侵食に起因 H&E染色の効率と10秒(B)および大動脈クランプ(C)の10分後。核染色の欠如によって確認することができるように、完全にクランプ血管は、内皮層をdenudes。また、平滑筋細胞核の損失は、中膜への損傷を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3:クランプ時間の関係は、長さを創傷に下腹部大動脈クランプを10秒、1分、10分間行いました。直ちに損傷後の、免疫細胞化学は、偽手術と示す(A)のように、高解像度(B)でのこれらの時点のために顔エン行きました。 (紫)フィブリノーゲンは、損傷の面積を特定します。 βカテニン(赤)は、内皮境界を特定します。アスタリスク(*)がクランプ適用領域をマーク。 βカテニンの不在は、損傷の領域における内皮細胞の欠如を示しています。 (C)は、クランプ時間を増加させること(各時点についてはn = 2)露出面積を増大させることを示すために裸出傷害領域のマーカーとしてフィブリノゲン染色を使用します。エラーバーは標準偏差を表す。 時間をクリックしてくださいこの図の拡大版を表示するには、ERE。
図4:1分間大動脈クランプ損傷後エリア 24時間の同定は 、大動脈を切開し、内膜を露出するように切断しました。 4%パラホルムアルデヒドで固定した後、免疫細胞化学は、 顔専用行きました。 (紫)フィブリノーゲンは、損傷の領域を特定します (A)。創縁(B)の傷(C)内の高倍率が示されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5:侵食に起因の再現性再内皮の傷害および同定。二十四時間は、損傷後、大動脈は顔エン述べたとを施行免疫細胞化学のように切開しました。裸出傷害のマーカーとしてフィブリノゲンを使用して、高度に再現可能な損傷は0.81 mm 2での平均露出面積を有する(A)において観察された(n = 6)。高解像度画像が表示その創傷縁を呈するフィブリノゲン染色および無傷内皮(C)と比較して、移行内皮細胞(矢印、紫色の染色)(B)。エラーバーは標準偏差を表す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
表1:85マウスの手術と術後死亡率合計underw85.9パーセントの生存率との耳鼻咽喉科生存infrafrenal腹部大動脈クランプ。マウス8匹(9.4%)が原因で、腸出血や大血管の穿孔に手術を生存しませんでした。 4匹のマウスは、術後に死亡しました。
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Discussion
このようなバルーン血管形成術および血管ステント留置などの経皮的介入への動脈削剥損傷は、初期および後期の血管血栓症および再狭窄を生じ、再発性虚血性イベント3,12に貢献しています。興味深いことに、外科的血管クランプはまた、13経皮的またはオープンかどうか、任意の血管手術を受ける患者に問題の範囲を拡大し、動脈侵食の原因として関与しています。減損再内皮が血栓症および再狭窄のかなり認識原因ですが、再内皮の周囲の分子メカニズムは解明が困難でした。動物モデルは、動脈削剥損傷後の再内皮のさらなる理解を得るために必要になってきています。
動脈裸出損傷の細胞および分子の効果を研究するために、既存の動物モデルは、ブタ、ウサギおよびげっ歯類7,9-11のものが含まれます。げっ歯類のmod頻繁に使用されるELSラット頚動脈バルーン傷害モデル、マウスワイヤ傷害モデル、およびラットとマウス結紮モデル14,15を含みます。ラット頸動脈バルーン傷害モデルが最もよく特徴付けられ、最も一般的に使用されるが、マウスでリンドナーによって記載頚動脈傷害手順は、トランスジェニック系統16,17を使用する可能性を広げています。遺伝的に改変されたマウスモデルは、薬理学的阻害剤に関連した潜在的なオフターゲット効果と特異性の問題の発生率を減少させ、および組織特異的および関心の特定の要素の条件付きアブレーションを可能にすることができます。それにもかかわらず、マウスにおける頚動脈損傷は非常に厳しいと行うことは困難です。
ここで説明下腹部大動脈のマウス動脈削剥モデルが適用するのが比較的容易であり、in vivoでの大口径動脈の再内皮の研究を可能にします。手術は許容可能なシュールを示しました85.9パーセントのvival率。傷の長さは血管クランプが血管を閉塞されたクランプジョーの寸法、クランププレスの強さ、および時間の長さに依存しています。このモデルは、高い再現性である0.88ミリメートル2削剥損傷を生成するために1分間10×1.75ミリメートルの顎寸法と「強い」クランププレスを使用しています。創傷の長さの変動は、異なるジョー寸法および血管閉塞の長さで観察されました。また、露出面積が連続吻側から尾側に下腹部大動脈をクランプすることによって拡張することができます。このように、このモデルは、自分の研究の目的に合うように操作することができる削剥傷害サイズに汎用性を提供しています。
損傷後、損傷および内皮閉鎖率の程度を評価するために、免疫細胞は、内皮細胞核とTを識別するためのフィブリノゲンを識別するために、内皮細胞間結合またはERGを識別するためにβカテニンに対する抗体を用いて種々の時点で行いました。彼はエリアを負傷しました。再内皮化が発生したように、フィブリノゲン染色は、再内皮化の程度と比較して、元の損傷を同定するために使用しました。フィブリノゲンの強い染色が著しく内皮の再成長した後に減衰している間、さらには少なくとも4日後に、手術後に元の障害を識別するために十分な強度が残っています。
このモデルには制限がないわけではありません。任意の動物モデルと同様に、マウスの手術は良い外科技術を必要とし、学習曲線を伴います。解剖を制御することができない場合があるケア、で行われていない場合マウスはすぐに血管穿孔に屈することができます。手術死亡の最も一般的な原因は、それぞれ5.9%と3.5%で、腸の出血および大血管穿孔が含まれていました。しかし、慎重に解剖して、出血はまれであり、血液の損失は、通常、私たちの経験では0.1 ml以下に抑えることができます。また、大動脈の適切な解剖し、適切なクランプ配置は、再現性の傷害に不可欠です。遠位大動脈拍動を調べることは、完全な大動脈閉塞を確認するために使用することができるが、大動脈にすべての後腹膜組織の付着を除去してクリーンな、途切れのない傷を得るために不可欠です。前述したように、中膜への損傷は、大動脈のクランプのこの手順を留意されたいです。しかし、内側平滑筋の死は、その後の新生内膜過形成18における長期または慢性の血管によるステント移植に拡大し、その結果のよく知られた結果です。私たちは何の術後死を持っていないし、これらのマウスは、術後2ヶ月まで生存してきたように、我々のモデルで内側の損傷は、病理学的後遺症を持つように表示されません。
我々は良い生存率と再現性のある下腹部大動脈の動脈裸出損傷の汎用性の高いマウスモデルを提示します。このモデルは、トランスジェニックマウスモデルの多数で動脈損傷を研究するための必要性を満たします。養子縁組Oこのマウスモデルfは、正常および病理学的条件下での再内皮化の分子機構を解明するために使用することができます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
この作品はMLIAに再生医療のイーライとエディスブロードセンターからの助成金によってサポートされており、AIMにASSとAIM、フィリップ・J. WhitcomeフェローシップにUCLAトレーニングプログラムで幹細胞研究、および国立衛生研究所(HL130290)しました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Zeiss Discovery.V12 Stereomicroscope | Zeiss | 495037-9904-000 | |
Rodent Heated Surgical Platform | Protech International | RES4000 | Heated platform for body temperature maintenance with nosecone for anesthestic maintenance and on which surgical procedure is performed |
Isoflurane | Henry Schein | 50033 | 4% Induction; 2.5% Maintenance |
Isoflurane Vaporizer | Summit Medical Equipment | 470062 | |
Stryker T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | |
Artifical Tears Lubricant Opthalmic Ointment | Akorn Animal Health | 17478-162-35 | |
Carprieve (Carprofen) | Norbrook Laboratories | NDC 55529-131-01 | |
Oster™ A5 Professional Animal Clipper | M.Schneider & Sons Inc. | 78005010 | Use with animal clipper size 40 |
Adjustable Wire Retractor | Fine Science Tools | 17004-05 | |
Schwartz Micro Serrefines - Sharp Bend | Fine Science Tools | 18052-03 | |
Surgical Instruments | Fine Science Tools | sharp dissecting forceps, blunt forceps, fine scissors, spring scissors, hemostat | |
0.5% Marcaine | Hospira | 0409-1610-50 | |
5-0 Suture, Vicryl | Fisher Scientific | NC0189890 | tapered needle |
Vetbond | Fisher Scientific | NC0304169 | |
Falcon® 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 3097358-1004 | |
Dissecting pins | Fisher Scientific | NC9681411 |
References
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