Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Resumen

Se describe un método para medir la difusión de proteínas en las membranas de las células inmunitarias primarias mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS). En este trabajo se ilustra el uso de anticuerpos para el marcaje fluorescente.

Resumen

espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una poderosa técnica para el estudio de la difusión de las moléculas dentro de las membranas biológicas con una alta resolución espacial y temporal. FCS puede cuantificar el coeficiente de concentración y la difusión molecular de moléculas marcadas con fluorescencia en la membrana celular. Esta técnica tiene la capacidad de explorar las características de difusión molecular de las moléculas en la membrana plasmática de las células inmunes en el estado de equilibrio (es decir, sin procesos que afectan el resultado durante el tiempo de medición real). FCS es adecuado para el estudio de la difusión de las proteínas que se expresan en niveles típicos de proteínas más endógenas. Aquí, se demuestra un método sencillo y robusto para determinar la velocidad de difusión de las proteínas de la membrana celular en los linfocitos primarios. se describen Una manera eficaz de realizar mediciones en células vivas de anticuerpos manchados y observaciones que ocurren comúnmente después de la adquisición. Los avances recientesen el desarrollo de los tintes fluorescentes foto-estable pueden ser utilizados por la conjugación de los anticuerpos de interés de apropiarse de tintes que no usar lejía ampliamente durante las mediciones. Además, esto permite la detección de entidades que se difunden lentamente, lo que es una característica común de las proteínas expresadas en las membranas celulares. se pone de relieve el procedimiento de análisis para extraer parámetros de concentración y de difusión molecular a partir de las curvas de autocorrelación generados. En resumen, se proporciona un protocolo básico para las mediciones de FCS; que puede ser seguido por los inmunólogos con una comprensión de la microscopía confocal, pero con ninguna otra experiencia anterior de técnicas para la medición de parámetros dinámicos, tales como velocidades de difusión molecular.

Introducción

Muchas funciones células inmunes se basan en la difusión molecular y las interacciones dentro de las membranas. Las membranas biológicas son complejos, y muchos factores que pueden ser importantes para la función de las células inmunes puede influir en la velocidad de difusión de traslación de las proteínas dentro de las membranas celulares ^1. Recientemente, hemos mostrado que las células asesinas naturales (NK), los linfocitos que pertenecen al sistema inmune innato, exhiben la difusión diferencial de dos proteínas estudiadas en la membrana celular en función del estado de activación de las células NK ^2.

Protocolo

1. La tinción para FCS

1. Aislar células NK murinas a partir de linfocitos de bazo utilizando etiquetado perla magnética, según el protocolo del fabricante ^16. Utilice 2-3 x 10 ⁵ células por muestra para los siguientes pasos.
   NOTA: Utilice la selección negativa para enriquecer la población de células diana, dejándola intacta, de modo que las células pueden marcarse con anticuerpos primarios solo. Véase la referencia ² para obtener información más detallada sobre el aislamiento de células de ratones ^2.
2. Para las células murinas que expresan receptores de Fc, bloque....

Resultados

Un resultado típico generará una curva de autocorrelación con un tiempo de tránsito en el intervalo de 10 mseg a 400 mseg para proteínas de membrana. El número de moléculas puede variar entre 0,5 a alrededor de 200 por m ² para proteínas expresadas de forma endógena. Compruebe cuidadosamente que el CPM no es menor de lo esperado. Esto puede significar que hay una influencia de la señal de fondo. Como regla general, la señal de CPM en las células que se acepta para el análisis .......

Discusión

Este protocolo de FCS se puede utilizar para la evaluación de la dinámica molecular de moléculas de la superficie de todos los tipos de células inmunes (murino, humano, u otras especies). Medidas FCS dinámica molecular espacio-temporales abajo a la resolución de una sola molécula en las células vivas. La densidad molecular, así como la dinámica del tipo de difusión y la agrupación de las proteínas de interés, se pueden extraer de las curvas de autocorrelación.

El marcaje fluorescente es de i.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
MACS NK Cell Isolation Kit ratón II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Selección negativa de células NK
Suero fetal bovino	Sigma-Adlrich	F7524
Solución salina tamponada con fosfato	-	-	Hecho en casa
Roswell Park Memorial Institute medio 1640	PAA La Compañía de Cultivo Celular	E15-848	Medio transparente
Clon de anticuerpos 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	Para el bloqueo de receptores Fc.
Anticuerpo anti-Ly49A			Anticuerpo monoclonal fabricado internamente y conjugado internamente con el anticuerpo Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd	BD Pharmingen	558915	Conjugado internamente con MFP488
Clon 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Colorante fluorescente para la conjugación de anticuerpos.
Poly-L-Lisina	Sigma-Aldrich	P8920	Diluido en agua destilada (1.10)
Poli-L-Lisina (20 kDa) injertado con polietilenglicol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluido en PBS (pH 7.4) a 0.5 mg/ml.
Cloruro de rodamina 110	Sigma-Aldrich 432202		Coeficiente de difusión conocido: 3.3 × 10− 10 m2/seg 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Coeficiente de difusión conocido: 4,4 veces; 10&menos; 10 m2/seg 20
Microscopio confocal	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
	Matlab	versión R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 pocillos, fondo de borosilicato 1.0

inactivado por calor Software: Matlab con caja de herramientas de ajuste de curvas