Summary
En detaljerat förfarande för syntes av en 125 I-märkt azid och radiomärkning av dibenzocyclooctyne (DBCO) -grupp-konjugerade, 13-nm stora guldnanopartiklar med hjälp av ett kopparfritt klick reaktion beskrivs.
Protocol
Varning: Den oxiderade formen av radioaktivt jod är ganska flyktiga och måste hanteras med lämpliga bly sköldar och bly flaskor. Alla radiokemiska steg bör utföras i ett väl ventilerat träkol filtrerad huva, och experimentella procedurer måste övervakas av radioaktivitet detektorer.
1. Framställning av kemikalier och omvänd fas kassett för syntes av den 125 I-märkt Azid
- Beredning av reagens i lösning
- Lös upp 1 mg av aziden prekursor (2) i 150 | j, l absolut etanol (figur 1).
OBS: Ett detaljerat syntesförfarande för aziden föregångare (2) rapporterades i föregående papper 22. - Upplös 1 mg kloramin T i 20 pl 1 x fosfatbuffrad saltlösning (pH = 7,4).
- Lös upp 2 mg natriummetabisulfit i 20 | j, l H2O
- Lös upp 1 mg av aziden prekursor (2) i 150 | j, l absolut etanol (figur 1).
- beredningarning av patronen
- Tvätta TC18 patronen med 10 ml absolut etanol, följt av 10 ml H2O Torka inte matrisen av patronen med luft.
2. radiosynthesis av 125 I-märkt Azid prostetisk grupp
- Radiojodering reaktion av prekursorn
- Lägga aziden prekursorlösningen (1 mg i 150 | il absolut etanol) och ättiksyra (10 | il) till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 150 MBq [125 I] Nal i 0,1 M NaOH (50 | il) till reaktionsblandningen.
- Lägga till en kloramin T-lösning (1 mg i 20 pl 1 x fosfatbuffrad saltlösning) och stäng mikrocentrifugrör innehållande reaktionsblandningen.
- Inkubera reaktionsblandningen vid rumstemperatur i 15 min tills radiojodering reaktionen är avslutad.
- Lägga till en natriummetabisulfitlösning (2 mg i 20 | il H2O) till reaktionsblandningenatt släcka radiojodering reaktionen.
- Återkalla 0,2 | il av den råa produkten och sedan späda ut det med 100 pl av lösning (H2O / CH3CN, 1: 1) för HPLC-analys.
OBS: För alla HPLC-experiment, använda 0,1% myrsyra innehållande H2O (lösningsmedel A) och 0,1% myrsyra innehållande acetonitril (lösningsmedel B) som elueringsmedel. - Analysera utspädda råprodukten med hjälp av en omvänd fas analytisk radio HPLC (C18 omvänd fas-kolonn; flödeshastighet: 1 ml / min, eluent gradient: 20% lösningsmedel B under 0-2 min, 20-80% lösningsmedel B under 2-22 min, 80-100% lösningsmedel B under 22 till 23 min och 100% lösningsmedel B under 23 till 28 min; retentionstid: 16,4 minuter) (figur 2).
- Rening av den råa produkten med en preparativ HPLC
OBS: Ge tillräckligt blyavskärmning runt HPLC delar såsom injektorn kolonn, detektor, samling flaskor och behållare i vilken utflödet samlas.- dra tillbaka the Hela reaktionsblandningen in i en HPLC-flaska. Skölj reaktionsröret med acetonitril (0,5 ml) och tillsätt skölj in i samma injektionsflaska. Späd den uppsamlade lösningen med H2O (1 ml).
- Injicera den råa produkten på en preparativ radio-HPLC (C18 omvänd fas-kolonn; flödeshastighet: 10 ml / min; elueringsmedel gradient: 20% lösningsmedel B under 0-2 min, 20-80% lösningsmedel B under 2-22 min, 80-100% lösningsmedel B under 22 till 23 min och 100% lösningsmedel B under 23 till 28 min).
- Samla in det radioaktiva topp som representerar den 125 I-märkt azid (1) (tR under dessa HPLC-betingelser är 17,8-18,8 min) i ett provrör av glas (figur 2).
- Mäta radiokemiska utbytet för fraktionen med användning av en radioaktivitets doskalibrator enligt tillverkarens protokoll.
- Injicera den renade produkten in i en analysradio HPLC med användning av samma HPLC-betingelser för bestämning av radiokemiska renheten hos produkten.
- Fast fas extraktion av produkten
- Späd den fraktion som innehöll den önskade produkten (1) med 40 ml rent H 2 O.
- Lägg den utspädda lösningen i en kondition TC18 patron.
- Tvätta patronen med en ytterligare 15 ml H2O
- Eluera produkten (1) instängd i patronen med 2 ml aceton i en 10-ml glasflaska som är skyddad av ett blyskydd. Mäta radioaktiviteten hos den eluerade produkten med användning av en radioaktivitets doskalibrator enligt tillverkarens protokoll.
OBS: Dimetylsulfoxid (DMSO) eller absolut etanol kan också användas för eluering av produkten från patronen. Cirka 5-10% av radioaktiviteten pinnar normalt till kassetten, och den kvarvarande radiomärkta produkten kan inte helt elueras genom användning av överskottsmängder av organiskt lösningsmedel. - Indunsta aceton med en ström av kväve eller argongas.
- Upplösa residue med DMSO (100-200 | il) för nästa radiomärkning steg.
3. Syntes av DBCO-grupp-konjugerade guldnanopartiklar
- Ytmodifiering av 13-nm-stor guldnanopartiklar med DBCO-grupp-innehållande polyetylenglykol
- Förbered natrium-citrat-stabiliserade guldnanopartiklar (3) (medelstorlek = 13 nm) enligt en tidigare rapport 24.
- Lägga en vattenlösning av Tween 20 (1 mM, 1,5 ml) till de citrat-stabiliserade guldnanopartiklar (10 nM, 15 ml). Skaka lösningen under 20 min på en skakapparat.
- Lägga till en vattenlösning av DBCO-grupp-innehållande polyetylenglykol tiol (medelmolekylvikt = 5000, 100 ^ M, 1,5 ml). Skaka lösningen under 2 timmar på en orbital skakanordning.
- Rening av DBCO gruppmodifierad guldnanopartiklar
- Rena DBCO gruppmodifierad guldnanopartiklar (4) </ Strong> genom successiv centrifugering (11.400 xg, 15 min x 3).
- Dekantera supernatanten och tillsätt rent vatten för resuspension av guldnanopartiklar pellets.
4. Radiomärkning av DBCO-grupp-modifierade guld nanopartiklar via koppar fria Klicka Reaktion
- Syntes av 125 I-märkta guldnanopartiklar med användning av 125 I-märkt azid (1)
- Bered en koncentrerad lösning av DBCO gruppmodifierad guldnanopartiklar med hjälp av centrifugering (11.400 xg, 15 min), och justera koncentrationen av guldnanopartiklar till 2 iM.
- Lägg 4,1 MBq av 125 I-märkt azid (1) i DMSO (5 | il) till en suspension av guldnanopartiklar (4) (2 | iM, 50 | j, l).
- Inkubera den resulterande reaktionsblandningen vid 40 ° C under 60 min.
- Återkalla en portion (0,2 l) från den råa produkten och applicera den på en kiseldioxid-coated tunnskiktskromatografi (TLC) -platta.
- Utveckla TLC-plattan med användning av etylacetat som mobil fas.
- Placera TLC-plattan på en radio-TLC-scanner och köra skannern för att övervaka radiomärkningsreaktionen (figur 3) i enlighet med tillverkarens protokoll.
- Rening av den råa produkten
- Rena reaktionsblandning innehållande de 125 I-märkta guldnanopartiklar (4) genom centrifugering (11.400 xg, 15 min).
- Dekantera supernatanten och tillsätt rent vatten för resuspension av guldnanopartiklar pellets.
- Återkalla en portion (0,2 l) från den renade produkten och applicera den på en kiselbelagd TLC-platta.
- Utveckla TLC-plattan med användning av etylacetat som rörlig fas.
- Placera TLC-plattan på en radio-TLC-scanner och köra skannern för att bestämma den radiokemiska utbytet och radiokemisk renhet av 125 I-märkt gold nanopartiklar (4) (Figur 3) enligt tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den radiojodering reaktion av stannylerad prekursorn (2) utfördes med användning av 150 MBq [125 I] NaI, ättiksyra och kloramin T vid rumstemperatur under 15 min för att åstadkomma den radiomärkta produkten (1). Efter preparativ HPLC-rening av den råa blandningen, erhölls den önskade produkten erhålls med 75 ± 10% (n = 8) av den radiokemiska utbytet. Analytisk HPLC visade att den radiokemiska renheten av 125 I-märkta produkten var mer än 99% (Figur 2), och den observerade specifika radioaktiviteten hos produkten 1 är 40,7 MBq / imol. Fast fas extraktion av fraktionen innehållande den renade produkten med hjälp av patronen försedd en acetonlösning av 1. Användning av en ström av kväve eller argongas, kan det organiska lösningsmedlet avdunstas, och återstoden kan lösas på nytt i DMSO eller absolut etanol för nästa stes.
För 125 I-märkning av polyetylen-glykolmodifierat guldnanopartiklar, var DBCO-group-modifierade guldnanopartiklar bereds enligt förfarandet som visas i figur 1. En överskottsmängd av polyetylenglykol tiol (MW 5000) med DBCO grupper fick reagera med den citrat, stabiliserad 13 nm guldnanopartiklar. Efter modifieringssteget, renades produkten genom successiv centrifugering för att ge de DBCO-funktionaliserade guldnanopartiklar (3). I radiomärkning steget invägdes 3,7 MBq 1 sattes till 2 | iM av 3 (~ 400 pM av de DBCO grupperna), och märkningsreaktionen genomfördes vid 40 ° C under 1 timme. Radio-TLC-analys visade att mer än 95% av ett omsattes med DBCO-gruppfunktionguldnanopartiklar (3) inom 60 minuter. Reaktionen genomfördes under 60 min, och sedan den råa produkten var purified genom centrifugering. 125 I-märkt guldnanopartiklar (4) erhölls med> 99% (n = 4) radiokemiska utbytet bestämt genom radio TLC (Figur 3).
Figur 1. radiosynthesis av 125 I-märkt azid (1) och 125 I-märkta guldnanopartiklar (4). Reagens och betingelser: (a) [125 I] NaI, ättiksyra, kloramin T, RT, 15 min, 75 ± 10% (n = 8) radiokemiska utbytet; (B) DBCO-PEG-SH (MW 5000), H2O, RT, 2 h; ~ 40 ° C, 60 min,> 99% radiokemiska utbytet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
t = "Bild 2" src = "/ filer / ftp_upload / 54.759 / 54759fig2.jpg" />
Figur 2. Analytisk HPLC kromatogram av 125 I-märkt azid (1). (A) radiokromatogram av den råa produkten. (B) radiokromatogram av den renade produkten. (C) UV-kromatogram (254 nm) av den renade produkten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Radio-TLC-resultaten från de 125 I-märkta guldnanopartiklar (4) (Rf av 4 = 0,05, Rf av ett = 0,45, elueringsmedel: etylacetat) (a) efter en 60 minuters reaktion och (b) efter rening./ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54759/54759fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I allmänhet, den observerade radiokemiska utbytet av det renade 125 I-märkt azid (1) var 75 ± 10% (n = 8). Den radiomärkning utfördes med 50-150 MBq radioaktivitet, och radiokemiska resultaten är ganska konsekvent. Om [125 I] NaI (t 1/2 = 59,4 d) som genomgick radioaktivt sönderfall under mer än en månad användes i radiojodering reaktionen kan den radiokemiska utbytet av 1 observerades vara minskat något (53-65%). Därför rekommenderas det att [125 I] NaI användas så snart den produceras eller levereras till labbet för att få optimal radiokemiska utbytet. Dessutom bör en nyframställd kloramin T-lösning också användas i reaktionen för att erhålla den önskade radiokemiska utbytet.
Eftersom prekursorn (2) var ganska hydrofob, bör 150 | j, l absolut etanol tillsättas för att upplösa 1 mg
Innan användning av preparativ HPLC för rening av den råa produkten, som innehåller 1, behöver den omvända fas-HPLC-kolonn för att tvättas med lösningsmedel A och B (flödeshastighet: 10 ml / min, eluent gradient: 100% lösningsmedel B under 0-10 min, 100 -0% lösningsmedel B under 10 till 25 min, och 0% lösningsmedel B under 25 till 30 min) för att avlägsna spårmängder av orenheter från systemet. Därefter omvänd fas-HPLC-kolonn ekvilibrerad med 20% lösningsmedel B i 80% lösningsmedel A under minst 20 minuter för att erhållakonsekvent retentionstiden för en.
Fraktionen innehållande renad 1 bör spädas med mer än 4 gånger volymen av H2O i fast fas extraktionsförfarande. Annars, en del av den renade produkten inte kan fastna i TC18 patron. När aceton användes för att eluera renat ett från patronen, kan den slutliga volymen reduceras genom indunstning av aceton med en ström av kväve eller argongas vid omgivningstemperatur.
Bland flera radioaktiva jod, 125 Jag valdes och användes i aktuell forskning. Olika typer av jod radioisotoper måste testas med användning av föreliggande metod i andra biologiska och medicinska studier (t.ex. 124 Jag PET imaging, 131 I för terapeutiska syften).
Såvitt vi förstår, är den nuvarande radiomärkning protokollet första rapport som beskriver detalj synthetic steg för en radiojod-märkt azidgrupp. Nyligen publicerade vi en annan azid prostetisk grupp, som har en annan struktur 23. Men den radiomärkta azid (1) i den nuvarande metoden ges något bättre radiokemiska resultat än andra när det gäller radiomärkning effektivitet med DBCO-gruppinnehållande molekyler. Befintliga prostetiska grupper (dvs, N-hydroxisuccinimid och maleimid) för märkning av radioaktivt jod kan inte ge plats specificitet. Men visar den nuvarande metoden enkel radiomärkning effektivitet tillsammans med utmärkt bioorthogonality. Eftersom aziden funktionell grupp är känt för att vara mycket stabil i fysiologiska förhållanden och in vivo-miljöer kan den radiomärkta produkten (1) utnyttjas i pre-riktad in vivo imaging studier. Vi räknar med att denna metod kommer att tillämpas effektivt både in vitro och in vivo jod radioisotopen laBeling av biomolekyler och nanomaterial som innehåller en ansträngd cyclooctyne struktur.
Baserat på den specifika radioaktiviteten för en, är den beräknade molära förhållandet av 125 I- och guldnanopartiklar ~ 1:. 1 125 l-märkta guldnanopartiklar (4) kan användas i molekylär avbildning och biofördelningsstudier av nanomaterial. Den nuvarande metoden kan även tillämpas på radioaktivt jod märkning av olika storlekar och former av guldnanomaterial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chloramine T trihydrate | Sigma | 402869 | |
| [125I]NaI in aq. NaOH | Perkin-Elmer | NEZ033A010MC | |
| Sodium metabisulfite | Sigma | S9000 | |
| Formic acid | Sigma | 251364 | |
| Sep-Pak tC18 plus cartridge | Waters | WAT036800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Acetone | Sigma | 650501 | |
| Ethanol | Sigma | 459844 | |
| Gold(III) chloride trihydrate | Sigma | 520918 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| DBCO PEG SH (MW 5,000) | NANOCS | PG2-DBTH-5k | |
| TLC silica gel 60 F254 | Merck | ||
| Analytical HPLC | Agilent | 1290 Infinity | Model number |
| Preparative HPLC | Agilent | 1260 Infinity | Model number |
| Analytical C18 reverse-phase column | Agilent | Zorbax Eclipse XDB-C18 | |
| Preparative C18 reverse-phase column | Agilent | PrepHT XDB-C18 | |
| Radio TLC scanner | Bioscan | AR-2000 | Model number |
| Radioisotope dose calibrator | Capintec, Inc | CRC -25R dose calibrator | Model number |
References
- Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
- Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
- Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
- Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
- Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
- Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
- Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
- Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
- Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
- Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
- Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
- Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
- Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
- Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
- Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
- Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
- Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
- Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
- Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
- Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
- Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
- Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).
