SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Summary

Qui, descriviamo un metodo di proteomica quantitativa utilizzando la tecnica di etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per analizzare gli effetti di HIV-1 su proteomi exosomal host. Questo protocollo può essere facilmente adattato alle cellule in diverse condizioni di stress o infezione.

Abstract

La proteomica è l'analisi su larga scala delle proteine. Le tecniche proteomiche, come la cromatografia liquida in tandem, possono caratterizzare migliaia di proteine alla volta. Queste potenti tecniche ci permettono di avere una comprensione sistemica dei cambiamenti cellulari, soprattutto quando le cellule sono sottoposte a vari stimoli, come infezioni, stress e condizioni di test specifiche. Anche con i recenti sviluppi, l'analisi del proteoma esosomiale richiede molto tempo e spesso coinvolge metodologie complesse. Inoltre, l'ampio set di dati risultante necessita spesso di un'analisi solida e semplificata per consentire ai ricercatori di eseguire ulteriori studi a valle. Qui, descriviamo un protocollo basato su SILAC per caratterizzare il proteoma esosomiale quando le cellule sono infettate da HIV-1. Il metodo si basa sulla semplice marcatura isotopica, sull'isolamento di esosomi da cellule marcate in modo differenziale e sull'analisi della spettrometria di massa. Segue l'estrazione dettagliata dei dati e l'analisi bioinformatica dei risultati proteomici. I set di dati e i candidati risultanti sono di facile comprensione e spesso offrono una grande quantità di informazioni utili per l'analisi a valle. Questo protocollo è applicabile ad altri compartimenti subcellulari e a un'ampia gamma di condizioni di test.

Introduction

Molte malattie umane, tra cui le infezioni virali, sono spesso associate a processi cellulari distintivi che si svolgono dentro e intorno alle cellule colpite. Le proteine, spesso in qualità di effettori cellulari finale, mediare questi processi. L'analisi delle proteine, spesso in grado di fornire informazioni preziose per l'ambiente locale di cellule colpite e ci aiutano a comprendere il meccanismo alla base della patogenesi della malattia. Tra le varie tecniche di analisi delle proteine, la proteomica tiene particolarmente grande promessa. Come un potente strumento, su larga scala, proteomica possono fornire una comprensione sistemica di processi cellulari....

Protocol

1. Colture cellulari e HIV-1

NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, si consiglia di verificare la vitalità delle cellule attraverso Trypan Blue colorazione ¹¹ e la loro proliferazione attraverso un saggio di MTT ^12. E 'inoltre fondamentale utilizzare media SILAC appena preparata. Varie linee cellulari possono essere usati, purché siano in fase attiva proliferativa, e sono suscettibili di HIV-1, o la condizione di test di scelta. In questo protocollo, usare la linea cellulare H9 come l'esempio.

1. Seed 2 x 10 ⁶ cellule H9 in ciascun pallone di coltura cellulare. G....

Results

La figura 1A è un diagramma di flusso che illustra la procedura di etichettatura SILAC ^21. Al fine di purificare gli esosomi, i campioni devono essere centrifugati tramite centrifuga. Figura 1B mostra le fasi di purificazione exosome di ultracentrifugazione di serie ^21. Una volta purificate, le esosomi sono oggetto di analisi sperimentale proteomica come indicato nella procedura.

Discussion

Nelle procedure descritte in questo documento, abbiamo dimostrato l'applicazione della tecnica SILAC per studiare l'effetto di HIV-1 sul proteoma exosomal host. Inizialmente, le cellule infette non infettate e HIV-1 sono differenziale marcati con isotopi. I exosomes differenziale etichettati vengono quindi purificati prima di eseguire l'estrazione di proteine. Avanti, cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem è impiegato per analizzare il proteoma exosomal. Infine, i dati risultanti spettrometria d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Linea cellulare H9	ATCC	HTB-176
Thermo	Fisher Thermo Fisher	15250061
Thermo	Fisher	V13154
Siero fetale bovino dializzato (FBS)
Fisher ... RPMI 1640	Thermo Fisher	89982	Versione DMEM (89983)
L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 per SILAC	Thermo Fisher	88434
L-Lisina-2HCl, 13C6 per SILAC	Thermo Fisher	88431
HIV-1 NL4-3	Programma di reagenti NIH AIDS	2480
Alliance HIV-1 p24	PerkinElmer	NEK050001KT
Centrifuga refrigerata a supervelocità	Eppendorf	22628045
Ultracentrifuga refrigerata	Beckman Coulter	363118	Dovrebbe essere in grado di raggiungere 100.000 x g
50 mL Provette da centrifuga coniche	Thermo Fisher	14-432-22
Provette per ultracentrifuga	Beckman Coulter	326823
SW 32 Ti Rotore	Beckman Coulter	369694
tampone RIPA	Thermo Fisher	89900
Cocktail di inibitori della proteasi	Thermo Fisher	78430
ThermoMixer		BCA Eppendorf
	Thermo Fisher	23250
Spettrofotometro	Biorad	1702525
SDS PAGE Apparecchio per gel	Thermo Fisher	EI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gel Novex		XV04200PK20
Reagente per colorazione in gel	Sigma Aldrich	G1041
Tripsina modificata per grado di sequenziamento	Promega	V5111
SpeedVac Concentratore	Thermo Fisher	SPD131DDA
Anticorpo contro l'annessina umana A5	Abcam	ab14196
Anticorpo contro la catena B della lattato deidrogenasi umana	Abcam	ab53292
Software grafico e statistico		SigmaPlot	o GraphPad Prism
Suite di software per proteomica quantitativa	Max Planck Institute of Biochemistry	Maxquant
Software e banche dati	Fornitori		Fare riferimento al testo principale per i dettagli