En metod för att extrahera Pigment från Squid<em> Doryteuthis pealeii</em

Summary

Ett protokoll för utvinning av pigment från nanostrukturerade granulat i bläckfisk Doryteuthis pealeii kromatofor presenteras.

Abstract

Cephalopods can undergo rapid and adaptive changes in dermal coloration for sensing, communication, defense, and reproduction purposes. These capabilities are supported in part by the areal expansion and retraction of pigmented organs known as chromatophores. While it is known that the chromatophores contain a tethered network of pigmented granules, their structure-function properties have not been fully detailed. We describe a method for isolating the nanostructured granules in squid Doryteuthis pealeii chromatophores and demonstrate how their associated pigments can be extracted in acidic solvents. To accomplish this, the chromatophore containing dermal layer is first manually isolated using a superficial dissection, and the pigment granules are removed using sonication, centrifugation, and washing cycles. Pigments confined within the purified granules are then extracted via acidic methanol solutions, leaving nanostructures with smaller diameters that are void of visible color. This extraction procedure produces a 58% yield of soluble pigments isolated from granules. Using this method, the composition of the chromatophore pigments can be determined and used to provide insight into the mechanism of adaptive coloration in cephalopods.

Introduction

Bläckfisk som bläckfisk, bläckfisk och bläckfisk har förmågan att dynamiskt ändra sitt utseende för att kamouflera och signalering. ^1-6 Denna funktion stöds delvis genom selektiv areal utbyggnaden av pigmenterade organ kallas kromatofor. ^4,7-9 kromatofor är mjuka ställdon som innehåller ett nätverk av nanostrukturerade pigmentkorn begränsade inom en cytoelastic säcken som är förankrad radiellt av muskelfibrer. ^1,3 När de påverkas, kromatofor växa med 500% i presenterade yta fördela kornen hela organ. ^{3,7 , 10,11} När denna åtgärd samordnade över ett antal kromatofor den totala färgningen av djuret ändras. Medan det är känt att pigmentgranulat bidra till denna färgförändring, förblir deras sammansättning okänd. Vi beskriver ett förfarande för att isolera och rena kromatofor pigment som kan anpassas för kommande kompositionsstudier.

<p class = "jove_content"> Isoleringen av pigmentgranulat innebär en flerstegsutvinning, homogenisering, och reningsprocedur. ^3,12 kromatofor innehållande vävnad skördas genom noggrann utrotande från bläckfisk. En matsmältning och homogeniseringsprocessen används sedan för att dissociera den omgivande vävnaden och separera kromatofor cellerna. De nanostrukturerade granuler isoleras därefter och renas från de återstående kromatofor som använder upprepad sonikering och centrifugering. Vid rening, pigment extraherade från granulerna i en process som är anpassad från utvinning av synlig färg från fjärilsvingar användning av sura metanollösningar. ¹³ Svepelektronmikroskopi (SEM) och spektrofotometri används för att bekräfta att de kromatofor pigmenten framgångsrikt extraheras med användning av denna process.

Denna metod beskriver isolering av kromatofor granulat som används för att undersöka de molekylära bidrag till coloration i bläckfisk. ¹² småmolekylära extraktioner från hela djur kan ofta vara en lång och mödosam process. Syftet är att informera framtida forskare i en effektiv och enkel protokoll för förvärvet av pigment från nanostrukturerade granulat i bläckfisk.

Protocol

Ryggradslösa djurstudier utförda häri regleras inte i USA; Därför Institutional Animal Care och användning kommittén har ingen myndighet för granskning av sådana protokoll. I stället för dessa inte faller under jurisdiktion av reglering i USA, författarna förklarar härmed att dessa studier genomfördes med uppriktig ansträngning mot etisk användning, vård och behandling av dessa djur, antalet individer minimerades och dessa ansträngningar är förenliga med Basel Deklarationen och International Council för försöksdjursv…

Representative Results

Kromatofor dissekeras från D. pealeii dorsal mantel (Figur 1A, 1B). När de tas bort, är kromatofor lyseras och renas med hjälp av centrifugering och tvättcykler för att isolera de pigmenterade granuler (figurerna 2A, 2B). Sura metanollösningar (HCl-MeOH) används för att extrahera pigment från granulerna (fig 2C), vilket gav ett lösligt pigment extrakt och olösliga, färglösa pigment…

Discussion

Vi har visat en metod för att extrahera pigment från bläckfisk kromatofor granuler. Genom att särskilt rikta granulerna, är vårt mål att bestämma deras roll i att medla adaptiv färg. Denna metod skiljer sig från tidigare rapporter som syftar till att karakterisera bläckfiskpigment med hjälp av bulkvävnadsprover ¹⁴ eller frystorkad hud ^15.

Även om detta protokoll är effektiv på att utvinna kromatofor pigment, är det begränsat till små reaktions skalor….

Materials

Collagenase	Alfa Aesar	9001-12-1	No hazard
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	3482-12-3	Irritant, acute toxicity
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9	Mild irritant
Hydrochloric acid	EMD Chemicals	7647-01-0	Corrosive
k-Aspartate	Sigma-Aldrich	1115-63-5	Reacts violently with oxidants
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3	Mild eye irritant
Methanol	Pharmco-AAPER	67-56-1	Highly flammable
Mini tablet prtoease inhibitor	Sigma-Aldrich	469315-90-01	Corrosive to metal and skin
Papain	Sigma-Aldrich	9001-73-4	Irritant