Summary
Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.
Abstract
Alzheimer hastalığı (AH) veya Parkinson hastalığı (PH) gibi ilerici nörodejeneratif hastalıklar dünya çapında insan sağlığı için artan bir tehdit vardır. Memeli modeller patojenite altında yatan mekanizmaların önemli bilgiler vermiş olsa da, birlikte maliyeti yüksek olan memeli sistemlerin karmaşıklığı kullanımını sınırlayan. Bu nedenle, basit ama köklü Drosophila modeli sistemi bu hastalıklarda etkilenen moleküler yolları araştırmak için bir alternatif sunuyor. Davranış bozukluklarla birlikte, nörodejeneratif hastalıklar, nöron ölümü ve axonopathy Histolojik fenotip ile karakterize edilir. nöronal dejenerasyonu ölçmek için ve genetik ve çevresel faktörlerden nasıl etkilendiğini belirlemek için, erişkin sinek beyinlerinde vakuoller ölçme dayalı bir histolojik yaklaşım kullanın. sistematik hata etkilerini en aza indirmek için doğrudan kontrol ve exp bölümler karşılaştırmak içinbir hazırlık erimental sinekler, biz parafin kesitler için 'yaka' yöntemini kullanın. Nörodejenerasyon daha sonra uçucu beyin gelişmiştir vakuollerin boyutu ve / veya sayısı ölçülerek değerlendirilir. Bu da ilgi belirli bir bölgeye odaklanarak ya da tam kafa yayılan seri bölümleri alarak, tüm beyin analiz yapılabilir. Normal yaşlanma sırasında oluşur Bu nedenle, bu yöntem, bir ağır dejenerasyon değil, aynı zamanda bir kaç bölümlerde sadece saptanabilir nispeten hafif fenotipleri sadece ölçmek için sağlar.
Introduction
beklenen yaşam süresinin artmasıyla birlikte, Alzheimer veya Parkinson gibi nörodejeneratif hastalıklar genel nüfus için artan bir sağlık tehdidi haline gelmiştir. Ulusal Sağlık Enstitüleri göre, 115 milyon insan, dünya çapında, altta yatan önemli bir ilerleme birçoğu için, bu hastalıkların en azından bazı rol oynayan genleri ve risk faktörlerini tanımlamada yapılmış olmasına rağmen 2050 yılında bunama etkilenecek tahmin edilmektedir moleküler mekanizmalar hala bilinmeyen ya da iyi anlaşılmış bulunmaktadır.
Caenorhabditis elegans ve Drosophila melanogaster gibi basit omurgasız model organizma kısa bir yaşam döngüsü, döl çok sayıda ve köklü ve bazen de eşsiz genetik ve moleküler yöntemlerin 1 kullanılabilirliği de dahil olmak üzere nörodejeneratif hastalıkların mekanizmaları incelemek için deneysel avantajlar sunuyoruz -12. Ayrıca, bu organizmaların tarafsız mükellef bulunmaktadırnörodejeneratif fenotipleri üzerine ağırlaştırıcı veya iyileştirmede etkileri ile bu hastalıklara katkıda bulunan faktörleri belirleyebilir etkileşim ekranlar.
Böyle genetik etkileşimleri analiz ve yaşlanma etkilerini değerlendiren nörodejenerasyonu tespit etmek ve şiddetini ölçmek için nicel protokolleri gerektirir. Sayısal performans değeri 13-21 sağlamak gibi koku öğrenme, olumsuz geotaxis, ya da hızlı phototaxis olarak Drosophila davranış yönlerini, ölçerken Bu değerlendirme nispeten kolayca yapılabilir. Nöronlarının sayılması ile nöronal hayatta kalma etkileri belirlemek de mümkündür. PD etkilendiğini ve o zaman bile, sonuçları 22-24 tartışmalı olmuştur dopaminerjik nöronlar gibi, açıkça tanımlanabilir belirli bir nüfus odaklanarak Ancak, bu mümkündür.
Burada açıklanan protokol parafin seri bölümleri gerçekleştirmek için yaka yöntemini kullanan bir yöntemBu aslında Drosophila 25 anatomik beyin mutantlar tecrit etmek için kullanılan Heisenberg ve Böhl, tarafından geliştirilmiştir. Yaka yönteminin kullanımı, daha sonra cryosections, vibratome bölümleri, ve plastik bölümlerin 26-28 de dahil olmak üzere, adapte edilmiştir. Burada, bu yöntem, daha sonra nörodejeneratif fenotipleri 16,21,29-32 olan sinekler gelişen hücre arası boşluklar ölçmek için kullanılabilir, tüm uçucu kafası seri bölümleri elde etmek için kullanılır. Bu ölçümler belirli beyin bölgelerinde yapılabilir ya da tüm beyin kapağı olabilir; İkinci yaklaşım yaşlanma sırasında gözlemlediği gibi biri bile zayıf dejeneratif fenotipleri tanımlamak için izin verir. yaka kullanıldığında, son olarak, 20 sinekler olan bir preparasyon olarak işlenebilir, sadece daha az zaman alan, ancak, aynı zamanda hafif değişikliklere eserler minimize, kumanda aynı hazırlanmasında deney sinekler analiz sağlar hazırlık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tasmalar üzerinde Başkanı Tespit ve Parafin katıştırma
Not: tespite tüm adımları, bir çeker ocak içinde yapılmalıdır. sağlık riski olduğu halde değil ise metilbenzoat, bir çeker ocak içinde ele takdirde çok zor olabilir, son derece belirgin bir koku vardır.
- sinekler anestezi önce, 15 ml kloroform ve% 99 etanol, 30 mL glasiyel asetik asit (5 mi kloroform ve asetik asit karışmaz) eklenerek Carnoy çözeltisi 50 mL oluşturur. yaka düz koymak ve tamamen çözelti ile kaplıdır emin olmak için, böyle bir kristalleştirme tabak gibi düz alt, bir cam kap içinde dökün.
- CO 2 veya eter ile sinek anestezisi.
- forseps kullanarak yaka içine boyunlarına Konu sinekler (yukarı çoğu yaka 20). Şekil 1A görüldüğü gibi, aynı yönde başkanları tüm hizalayın ve herhangi bir hasar ya da kafasına gözlerine meydana sağlamak için nazik olmayı unutmayın.
- Sinekler sırası kolayca bölümleri tespit edilebilir, böylece herhangi bir konumda olmazsa oculis sinekler (oklar, Şekil 1A) içerir. Deneysel sinekler hafif ya da beyaz göz rengi varsa ek olarak, bu tür vahşi türü olarak bazı kırmızı gözlü sinekler, iplik aralarında yeterli pigment slayt leke mevcut olduğundan emin olmak için. Birden fazla yaka kullanıyorsanız yaka numarası ile birlikte bir protokol kağıda sinekler sırasını kaydedin.
- 4 saat - yaka tamamlandıktan sonra, 3.5 için hazırlanan Carnoy çözeltisi içine koyun.
- Uygun bertaraf kabına Carnoy çözüm dökümü ve etanol yıkar başlar. kapta yaka yerleşimini rahatsız etmeyecek şekilde yavaşça dökün emin olun.
- iki kez% 99 etanol içinde 30 dakika boyunca halkalar yıkayın.
- 1 saat boyunca% 100 etanol içinde yaka yıkayın. overdehydration önlemek için zamanında yıkar değiştirmek emin olun.
- metilbenzoat içinde yaka koyunO / oda sıcaklığında N. metilbenzoat buharlaşmasını önlemek için parafilm kabı mühür.
- davlumbaz uygun tek kullanımlık kap içine methylbenozate dökün. (- 57 ° C 56) parafın balmumu ve metilbenzoat 1 düşük erime noktası: 1, daha önceden hazırlanmış karışımı ekleyin. Bu noktadan itibaren, yaka parafın sertleşmesine olmadığından emin olmak için, 65 ° C'de bir kuluçka tutulması gerekir.
- Uygun tek kap içine methylbenozate parafin karışımı üzerinden dökün ve erimiş saf parafin dökün, bilezik üzerine, 65 ° C'de tutuldu.
- 30 dakika sonra parafin değiştirin ve bu en az 5 kez tekrarlayın. en az 6-8 yıkama yapılmalıdır.
- yıkar tamamlandıktan sonra, yaklaşık yuvalara yaka boyutu ile bir lastik buz küpü tepsiye yaka yerleştirin. tamamen kapalı kadar onlar üzerinde erimiş parafin dökün ve O sertleşmesini sağlayan / N (hava kabarcıklarını önlemek için deneyin).
- parafin blokları contai kaldırning buz küpü tepsisinden yaka. yavaşça yaka kopması, bir jilet kullanarak yaka parafin blok ayırın. organları yaka kalacak ise kafaları parafin blok olacak. blok, oda sıcaklığında muhafaza edilebilir.
- yakaları temizlemek için, hafif fırçalama ile temiz parafin, kaldırmak ve tekrar kullanmadan önce etanol içinde yıkamak için 65 ° C'de deparafinization ajan onları ıslatın.
2. Kesit ve Montaj
- 50 ° C'ye kadar bir ısıtma plakası ısıtın. plaka üzerinde nesne tutucular (ya da metal montaj blokları) ve jilet yerleştirin ve onları ısınmasına izin verin.
- kesit için istenen yönde bağlı olarak, parafin (yatay bölümler için) tarafına doğru başkanları ile ya blok veya (kısaca temas tarafında blok erime) ısıtılmış montaj bloğuna (frontal kesitler için) yukarı bakacak ekleyin. ısıtma plakası blok çıkarın ve en az 10 mil soğumasını bekleyinn, parafın montaj bloğu üzerine bir sızdırmazlık için yeterli sertleştirilmiş olduğundan emin olmak için. engebeler bilmek mümkün olduğu kadar bloğun yüzeyi ile paralel yerleştirilmiş kafalarının satır tutun.
- Bir jilet alın ve gömülü başları sadece küçük bir satır kalacak şekilde uzak sinek kafaları aşırı parafin Döşeme (jilet daha kolay düzeltme için ısındı olabilir). parafin (kesit sırasında yapılabilir fazla kırpma) kesit sırasında sonu yok ki çok fazla süs için değil emin olun.
- mikrotom amacı tutucu içine yerleştirme bloğu yerleştirin ve kafaları sırasının hizalama kanadın kenarı mümkün olduğu kadar paralel olduğundan emin olun.
- poli-L-Lizin (PLL) solüsyonu ince bir tabaka ile kaplayarak mikroskop slaytlar hazırlayın ve 5 dakika boyunca kurumaya bırakın. kısa bir süre önce kullandığınız su ile bunları kapatın.
- 7 mikron bölümleri kesmek ve su üzerinde yüzen slayt bölümlerin şerit aktarın. <br /> Not: Yatay bölümler için tüm beyin elde etmek için, biz baş tamamen kesilene kadar (beyine burnumun kesme) göz içine kesmek için başlarken gelen kurdele toplamak. Birden fazla slayt tüm kafa için gerekli olabilir.
- 37 ° C'de bir ısı plakasında slayt yerleştirin ve şerit 1 dakika için genişletilmesine izin verir.
- (Kapalı dökme veya doku kullanılarak) aşırı su çıkarmak ve slaytlar O / N kurutun.
- Bir deparafinization ajan (tamamen bölümlerini kapsayan) ile dolu uzun boylu, dik slayt boyama kavanoz slaytlar yerleştirerek slayt parafin çıkarın. 60 dakika - her 30 dakika 3 yıkar gerçekleştirin.
- Nihai yıkama slayt çıkarın. slayt üzerine gömme medya 2 damla koyun ve büyük bir lamel ile örtün.
3. Bölümler Fotoğrafçılık ve Analizi
- 2 d - Hazırlanan slaytlar 1 kurumasını bekleyin. Sonra, bir floresan Microsc bunları incelemekmavi ışık altında ope.
- Sineklerin yönünü belirlemek ve belirli bir bölge üzerinde odaklanarak, eğer ilgi bölgeyi bulmak için daha düşük bir büyütme kullanın.
NOT: sws sinekler (Şekil 2) için, biz büyük komissürü içeren bölümünü bulun ve (genellikle 40X büyütme) bir görüntü alır. (Şekil 3'te olduğu gibi), tüm beyin analiz ederken, bir kafa tüm bölümleri ilerlemek ve en ağır fenotip veya vakuoller göstermek tüm bölümleri ile bölüm fotoğraf ya. - Bir çift-kör analizi için, almak ve sayı görüntüleri genotipi bilmeden ve daha sonra onları tanımlamak için üst üste yaka numarasını ve başın pozisyonunu kaydedin.
- görüntüler alınmıştır sonra bir görüntüleme yazılımı kullanarak bunları analiz eder.
- Bölüm başına veya başına vakuol sayısını. , Vakuol boyutunu ölçmek bir yazılım programında görüntüleri açın ve çok bir seçim ile vakuoller seçmek içinl. Seçilen vakuoller piksellerin miktarını belirlemek.
- Um 2 dönüşüm için, fotoğraf elde etmek için kullanılan büyütme bir sahne mikrometre kalibrasyonu slayt fotoğraf çekmek. Dönüşüm faktörünü hesaplamak için 100 um 2 piksel miktarını belirler.
- Yukarıdaki adımda hesaplanan dönüşüm faktörü ile piksel sayısına bölünmesiyle mikron 2 içine toplam piksel sayısını dönüştürün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm sinek kafasını kapsayacak göz pigmenti 33 ile boyanan seri bölümlerde açıklanan yöntem sonuçları kullanarak. Bunun bir kısmı tek bir kafa bölümleri üstten alta gösterilir Şekil 1B, 'de gösterilmiştir. Farklı sineklerden bölümleri bu örnekte soldan sağa görülür. Yönlendirme ve sineklerin tanımlanmasını kolaylaştırmak için, bir gözsüz sinek (sinüs oculis) konumuna 3 (ok, Şekil 1B) bir belirteç olarak eklenir.
nörodejenerasyonu ölçmek için, bu bölümler tespit edilebilir vaküol oluşumunu ölçer. Vakuoller yuvarlak olarak tanımlandığı gibidir, yeşil flüoresan nöropil olan (Şekil 2'de ok işaretleri ve 3) ya da korteks ve karanlık noktalar uçucu beynin en az 2 üst üste bölümlerde görebilir. tarafından nörodejenerasyon nicelölçme Vakuollerin ya belli bir beyin bölgesinde odaklanarak ya da tüm beyin analiz yapılabilir. Beynin belirli bir bölgeye analiz sınırlayan bir mutasyon sadece mutant 34 olk futsch 'koku loblar gibi, belirli bir bölgeyi etkileyen durumlarda yararlıdır, ancak tüm veya birçok şiddetli dejenerasyon olduğunda da kullanılabilir beyin bölgeleri. İkinci bir örnek tüm vakuoller ölçüm çok zaman alıcı olacaktır İsviçre peyniri (sws) mutant (Şekil 2) 'dir. Bu nedenle ölçümlerin her zaman aynı seviyede yapıldı sağlamak için, tek bir görüntü aldı ve biz sadece bir ya da iki bölüm halinde bulunan büyük bir komissür (gc, Şekil 2A), düzeyinde tüm görüntüleri aldı. Biz (veriler gösterilmemiştir) 1-günlük SWS '1 sinekler vakuol oluşumu tespit etmedi Oysa, bir kayıp fonksiyon-alel 35, bazı vakuoller saptanabilir i vardın 7 gün yaşlı SWS '1 sinekler (ok başları, Şekil 2A). 14 d (Şekil 2B) ve 21 d (Şekil 2C) sinekler Yaşlanma daha da ilerici niteliğini gösteren bu fenotip arttı. tarif edilen yöntem kullanılarak deutocerebral nöropil (DN) vakuoller sayısını sayma yaş vaküol sayısında belirgin bir artış olduğunu teyit etmiştir. Ayrıca, vakuollerde kapsadığı kombine alan önemli ölçüde (Şekil 2D) yaşlanma ile artmıştır.
Bununla birlikte, tüm mutantlar SWS gibi ciddi bir fenotip göstermektedir, ve bu durumda, dejenerasyon farklılıklar küçük bir alanda odaklanarak belirlemek zordur. Benzer şekilde, yaşlanma sırasında meydana dejenerasyon (Şekil 3A - C) oldukça hafiftir ve bu fenotip miktarının bu nedenle, biz tüm beyin analiz. ortaya beyinde tüm vakuollerinin toplamını belirlenmesiBu vakuol (Şekil 3D) kombine alan ölçerken önemli bir yaş artışı ve bu da böyleydi.
1. Parafin Seri Bölümler rakam. A) tasma yöntemi kullanılarak, deney ve kontrol sinekleri bir yaka üzerine onları geçirilerek tek bir örnek olarak işlenebilir. Gözsüz sinüs oculis sinekler oryantasyon (oklar) için eklenir. Yaka sinek kafaları yönünü gösteren B) şematik. C) Bu görüntüde, farklı sinek başlardan bölümleri slayt üzerinde soldan sağa yönlendirilmiş edilir. slayt üzerinde üstten alta bakıldığında, aynı uçucu baş kısmında seri kesitler görülebilir. Bu durumda, bir sinüs oculis uçucu pozisyonda üç (ok) yerleştirildi. bölümler üzerinde yıkar floresan göz pigmenti tarafından boyanan kesim sonrası bölümleri. A = 5 mm ve C = 0.5 mm 'deki ölçek çizgisi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Swiss-peynir Mutant 2. Aşamalı nörodejenerasyonu Şekil. 7-gün-(A), 14-gün-(B) ve 21-gün-(C) eski SWS '1 sinekler gelen Parafin baş bölümü. ok uçları yaşlanma ile geliştirdiğimiz vakuollerde işaret. Yaşa bağlı dejenerasyon vakuol sayısının sayılması ve kombine alana (D) ölçülmesi ile ölçülür. SEM ve analiz sineklerin sayısı belirtilir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. *** P <0.001.csource.jove.com/files/ftp_upload/54809/54809fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Nörodejenerasyon yaşla birlikte oluşur. 10-gün-(A), 30-gün-(B) ve 60-gün-(C), vahşi tür sinekler Parafin kafa bölümü. ok uçları yaşlı sinekler geliştirdik vakuollerde işaret. Yaşa bağlı dejenerasyon vakuol sayısının sayılması ve kombine alana (D) ölçülmesi ile ölçülür. SEM ve analiz sineklerin sayısı belirtilir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. *** P <0.001. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. </ A>
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tarif edilen yöntem, Drosophila beyinde nörodejenerasyonu ölçmek için bir araç sağlar. Belirli bir hücre tipi sayımı gibi diğer yöntemler, nörodejenerasyon tanımlamak için kullanılabilir, ancak bu yöntemin avantajı daha genel olarak uygulanabilir olmasıdır. hücrelerin sayılması bu hücrelerin güvenilir bir şekilde belirli bir antikor ya da her zaman mevcut değildir, bir hücreye özel markörün ekspresyonunu kullanarak tespit edilebilir olmasını gerektirir. Bundan başka, önemli ölçüde farklı sonuçlar aktivasyonu nedeniyle etiketleme ve saptama için kullanılan şartlar için, bu yöntem 24 ile elde edilebilir gösterilmiştir. dejenere hücreleri tespit etmek için bir başka yöntem de anti-aktif kaspaz 3 gibi, bu, sadece aktif hücre ölümü geçiren hücreleri tanımlar ve bu hücrelerin ölmüş sonra, artık tespit edilebilir, hücre ölümü, belirteçleri kullanılmasıdır. Burada sunulan yöntemin bir başka avantajı, herhangi bir boyama yüzünden autoflu gerekli olmasıdırzaman kazandırır ve boyama koşullarında değişikliklere neden eserler minimize göz pigmenti, neden orescence. Yöntemi kullanırken, sineklerin gözleri slayt leke için yeterli pigment, dikkat etmek önemlidir. Göz rengi çok açıksa, bazı vahşi tip ekleyerek yeterli ve hatta slayt üzerinde boyama sağlamak için tavsiye olurdu yaka uçar. Bu yöntemin diğer bir avantajı çok alanlarda, hatta aynı kafasında, incelenebilir olmasıdır. Verileri görünmüyor olsa da, biz lamina korteks 30,36 retina ve glial hücre kaybına nörodejenerasyonu incelemek için bu bölümleri kullandık. Burada tarif edildiği gibi, bu yöntem, yatay bölümleri içerir, ancak nesne tutucu üzerine erime sırasında 90 ° parafın blok çevirerek, bir de ön bölümleri elde edebilir. Böylece, bu yöntem uçucu beyinde nörodejenerasyon zamanında ve etkin bir ölçüm sağlar çok yönlü bir işlemdir. vac oluşumu nedeniyleuoles AH modelleri dahil olmak üzere, insan nörodejeneratif hastalıkların bir çok uçucu modelleri gözlenmiştir, PD, Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) ve poliglutamin-tekrarlar 16,37-40 neden olduğu hastalıklar, bu yöntem, nörodejeneratif fenotipleri ölçmek için kullanılabilir hastalık modellerinde çeşitli.
Genel olarak, bu protokol basit ve ekipmanın ilk kurulum gerçekleştirilir kez kolaylıkla tamamlandı olduğunu. Akılda tutulması gereken bazı notlar slayt olduğunda dikkatli bölümleri veya kafaları kaybetmek değil çok dikkatle parafin blokları trim ve su şerit overexpand değil, aşırı dehidratasyon kafaları önlemek için etanol yıkar zaman için vardır ısı blok üzerinde. şerit neden olabilir sinek başkanları yırtılma, çok genişletmek için izin ve ise şerit başları sırası kaybolabilir. Buna ek olarak, analizler yaparken genotip kör olma önyargı önlemek için gereklidir. Bu en iyi sli hazırlarken bir kişiyi sahip olarak elde edilirdes ve başka bir kişinin fotoğraf çekimi ve ölçümleri yapıyor iken kayıtlarının tutulması. Bu yöntemin sınırlamalardan biri sadece birkaç hücre dejenerasyonu tespit etmek çok zor olmasıdır. Bu durumda, etkilenen hücre popülasyonunun belirli bir lekenin daha fazla bilgi olabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, bir apoptotik hücre ölümünü belirlemek için bir TÜNEL lekelemesi daha özel yöntemler gerektirir hücre ölümü, farklı türleri arasında ayrım izin vermez. Son olarak, bu yöntem hücre ölümü ve aynı zamanda nöropilde vakuoller olarak algılanabilir olacağını aksonal dejenerasyon, ayırt edemez.
Bu sonuçlar gösterildiği gibi, bu yöntem, spesifik beyin bölgelerinde veya tüm beyin dejenerasyonu gidermek için kullanılabilir. fenotip oldukça güçlü olduğunda bizim deneyim, tüm beyin bölgelerinin etkilenen bile, sadece belirli bir bölgeyi analiz etmek yararlıdır. Bu önemli ölçüde iş yükünü azaltır ve etkilemezsonuç. Başlangıçta SWS mutant çeşitli alanlarda analiz edilmiş ve sadece bir alan karşılaştırırken fenotip ilerlemesinde de benzer sonuçlar gözlendi ve tüm alanlarda analizinde (veriler gösterilmemiştir). Bununla birlikte, açık bir biçimde tanımlanabilir bölgesi, farklı seviyelerde farklı kalan yüzeyler analizi bozulmaları önlemek için seçilmelidir unutulmamalıdır.
Buna karşılık, fenotip nispeten hafif olduğu durumlarda, belirli bir bölgedeki vakuoller bulma olasılığı düşük olduğundan, tüm beyin analiz etmek daha iyidir. 60-günlük bir sinekler bütün beyinde 5 vakuol - yaşla ilişkili nörodejenerasyonu belirlenmesi yalnızca 4 Sonuçlar Şekil 3'te gösterildiği gibi, örneğin, bu, bir durumdur. tüm beyinde hücre arası boşluklar sayma yaparken, bir büyük olanları çeşitli bölümler üzerinde uzatacaktır ise küçük vakuoller sadece bir bölümünde görünecektir dikkate almak zorundadır. adj ikincisi ile ilgili olarak, yakınlıkaynı vakuol çok parçalı olarak mevcut olup olmadığını belirlemek için nispeten kolay bir şekilde, çünkü Acent bölümler, bu yöntem kullanılarak (Şekil 1), başka bir avantaj sağlamaktadır.
Sonuç olarak, bu protokol, farklı nörodejeneratif hastalıkların birçoğu Drosophila modellerini incelemek için yararlı olabilir. iyileştirmek ya da neden olabilir ya da Alzheimer ve Parkinson gibi hastalıkların değiştirme altında yatan mekanizmalar hakkında çok önemli bilgiler sağlayabilir dejeneratif fenotip ağırlaştırmak etkileşim proteinleri belirlenmesi. Bu yayında, biz hayvanlar normalde geliştirmek ilericidir dejenerasyon tespit ama yaşlanma sırasında dejenerasyon artan göstermek için bu yöntemi kullanabilirsiniz. Buna ek olarak, bu yöntem aynı zamanda daha önce yeni eclosed sinekler mevcut olmalıdır gelişimsel bozukluklar, kaynaklanır dejenerasyonu belirlemek için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalog Number | |
| Collar | Genesee Scientific | TS 48-100 | We are using custom made collars that are made from one piece of metal instead of layers as the ones by Genesee. A description on how to make collars can be found at http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| Rubber ice cube tray for embedding | Household store | The size can be made-to-fit by glueing in additional walls | |
| Crystallizing dish | Fisher Scientific company | 08-762-3 | |
| Ether | Fisher Scientific Company | E138-1 | |
| Ethanol | Decon Laboratories Inc. | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | Distinct Odor - Use in fume hood! |
| Low Melting Point Paraffin Wax | Fisher Scientific Company | T565 | Make sure to keep extra melted in a 65°C waterbath |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| Microscope Slide | Fisher Scientific Company | 12-550D | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific Company | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | Three different containers for washes |
| Vertical Staining Jar with Cover | Ted Pella Inc. | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| Poly-L-Lysine Solution (PLL) | Sigma Life Science | P8290-500 |
References
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279 (2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annu Rev Neurosci. 26, 627-656 (2003).
- Calahorro, F., Ruiz-Rubio, M. Caenorhabditis elegans as an experimental tool for the study of complex neurological diseases: Parkinson's disease, Alzheimer's disease and autism spectrum disorder. Invert Neurosci. 11, 73-83 (2011).
- Chen, X., Barclay, J. W., Burgoyne, R. D., Morgan, A. Using C. elegans to discover therapeutic compounds for ageing-associated neurodegenerative diseases. Chemistry Central Journal. 9, 65 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Modeling human neurodegenerative diseases in transgenic systems. Hum Genet. 131, 535-563 (2012).
- Jaiswal, M., Sandoval, H., Zhang, K., Bayat, V., Bellen, H. J. Probing mechanisms that underlie human neurodegenerative diseases in Drosophila. Annu Rev Genet. 46, 371-396 (2012).
- Konsolaki, M. Fruitful research: drug target discovery for neurodegenerative diseases in Drosophila. Expert Opin Drug Discov. 8, 1503-1513 (2013).
- Kretzschmar, D. Neurodegenerative mutants in Drosophila: a means to identify genes and mechanisms involved in human diseases. Invert Neurosci. 5, 97-109 (2005).
- Kretzschmar, D., et al. Swiss cheese et allii, some of the first neurodegenerative mutants isolated in Drosophila. J Neurogenet. 23, 34-41 (2009).
- Li, J., Le, W. Modeling neurodegenerative diseases in Caenorhabditis elegans. Exp Neurol. 250, 94-103 (2013).
- Prussing, K., Voigt, A., Schulz, J. B. Drosophila melanogaster as a model organism for Alzheimer's disease. Mol Neurodegener. 8, (2013).
- Wentzell, J., Kretzschmar, D. Alzheimer's disease and tauopathy studies in flies and worms. Neurobiol Dis. 40, 21-28 (2010).
- Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. J Vis Exp. , (2011).
- Barone, M. C., Bohmann, D. Assessing neurodegenerative phenotypes in Drosophila dopaminergic neurons by climbing assays and whole brain immunostaining. J Vis Exp. , e50339 (2013).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss-cheese (SWS), the Drosophila orthologue of Neuropathy Target Esterase, is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. , (2015).
- Iijima, K., et al. Abeta42 mutants with different aggregation profiles induce distinct pathologies in Drosophila. PLoS One. 3, e1703 (2008).
- Krishnan, N., et al. Loss of circadian clock accelerates aging in neurodegeneration-prone mutants. Neurobiol Dis. 45, 1129-1135 (2012).
- Liu, H., et al. Automated rapid iterative negative geotaxis assay and its use in a genetic screen for modifiers of Abeta(42)-induced locomotor decline in Drosophila. Neurosci Bull. 31, 541-549 (2015).
- Papanikolopoulou, K., Skoulakis, E. M. Temporally distinct phosphorylations differentiate Tau-dependent learning deficits and premature mortality in Drosophila. Hum Mol Genet. 24, 2065-2077 (2015).
- Ping, Y., et al. Linking abeta42-induced hyperexcitability to neurodegeneration, learning and motor deficits, and a shorter lifespan in an Alzheimer's model. PLoS Genet. 11, e1005025 (2015).
- Sujkowski, A., Rainier, S., Fink, J. K., Wessells, R. J. Delayed Induction of Human NTE (PNPLA6) Rescues Neurodegeneration and Mobility Defects of Drosophila swiss cheese (sws) Mutants. PLoS One. 10, e0145356 (2015).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis Model Mech. 4, 701-707 (2011).
- Coulom, H., Birman, S. Chronic exposure to rotenone models sporadic Parkinson's disease in Drosophila melanogaster. J Neurosci. 24, 10993-10998 (2004).
- Navarro, J. A., et al. Analysis of dopaminergic neuronal dysfunction in genetic and toxin-induced models of Parkinson's disease in Drosophila. J Neurochem. 131, 369-382 (2014).
- Heisenberg, M., Böhl, K. Isolation of anatomical brain mutants of Drosophila by histological means. Zeitschrift für Naturforschung C. 34, 143 (1979).
- Han, P. L., Meller, V., Davis, R. L. The Drosophila brain revisited by enhancer detection. J Neurobiol. 31, 88-102 (1996).
- Lin, C. W., et al. Automated in situ brain imaging for mapping the Drosophila connectome. J Neurogenet. 29, 157-168 (2015).
- Strausfeld, N. J., Sinakevitch, I., Vilinsky, I. The mushroom bodies of Drosophila melanogaster: an immunocytological and golgi study of Kenyon cell organization in the calyces and lobes. Microsc Res Tech. 62, 151-169 (2003).
- Bettencourt da Cruz, A., Wentzell, J., Kretzschmar, D. Swiss Cheese, a protein involved in progressive neurodegeneration, acts as a noncanonical regulatory subunit for PKA-C3. J Neurosci. 28, 10885-10892 (2008).
- Bolkan, B. J., Kretzschmar, D. Loss of Tau results in defects in photoreceptor development and progressive neuronal degeneration in Drosophila. Dev Neurobiol. 74, 1210-1225 (2014).
- Cook, M., Mani, P., Wentzell, J. S., Kretzschmar, D. Increased RhoA prenylation in the loechrig (loe) mutant leads to progressive neurodegeneration. PLoS One. 7, e44440 (2012).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293, 711-714 (2001).
- Rasmuson, B., Green, M. M., Ewertson, G. QUALITATIVE AND QUANTITATIVE ANALYSES OF EYE PIGMENTS AND PTERIDINES IN BACK-MUTATIONS OF THE MUTANT wa IN DROSOPHILA MELANOGASTER. Hereditas. 46, 635-650 (1960).
- Bettencourt da Cruz, A., et al. Disruption of the MAP1B-related protein FUTSCH leads to changes in the neuronal cytoskeleton, axonal transport defects, and progressive neurodegeneration in Drosophila. Mol Biol Cell. 16, 2433-2442 (2005).
- Kretzschmar, D., Hasan, G., Sharma, S., Heisenberg, M., Benzer, S. The swiss cheese mutant causes glial hyperwrapping and brain degeneration in Drosophila. J Neurosci. 17, 7425-7432 (1997).
- Dutta, S., Rieche, F., Eckl, N., Duch, C., Kretzschmar, D. Glial expression of Swiss cheese (SWS), the Drosophila orthologue of neuropathy target esterase (NTE), is required for neuronal ensheathment and function. Dis Model Mech. 9, 283-294 (2016).
- Davis, M. Y., et al. Glucocerebrosidase Deficiency in Drosophila Results in alpha-Synuclein-Independent Protein Aggregation and Neurodegeneration. PLoS Genet. 12, e1005944 (2016).
- Dias-Santagata, D., Fulga, T. A., Duttaroy, A., Feany, M. B. Oxidative stress mediates tau-induced neurodegeneration in Drosophila. J Clin Invest. 117, 236-245 (2007).
- Kretzschmar, D., et al. Glial and neuronal expression of polyglutamine proteins induce behavioral changes and aggregate formation in Drosophila. Glia. 49, 59-72 (2005).
- Li, Y., et al. A Drosophila model for TDP-43 proteinopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3169-3174 (2010).
