Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.
Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller ‘finite elements’, FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a ‘heat map’ showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.
Finite Element (FE) modellering er en ingeniør teknik, der beregningsmæssigt kan beregne og kortlægge omfanget og placeringen af stammer, der handler på en struktur en. Modellen består af 3D-strukturen, repræsenteret ved en maskestørrelse på "Finite Elements", og det endelige resultat af analysen er underlagt en række faktorer, herunder strukturen og antallet af elementer i masken, størrelsen og placeringen af den mekaniske belastninger og materialeegenskaber. Materialeegenskaber beskrive visse aspekter af et materiales opførsel under en given type belastning; Youngs modul (E) beskriver elasticiteten af materialet, medens Poissons forhold beskriver den proportionale fald i bredden af et materiale til sin længde, når en prøve strækkes. FE modellering kan anvendes til at beregne en række variabler, herunder forskydning, stress, pres og tryk virkende på modellen ved at tage hensyn til de unikke inputdata om strukturen '; S form, placering og omfanget af belastninger og de specifikke materialeegenskaber.
FE modellering er meget udbredt i teknik 2 og i stigende grad til ortopædiske 3 og palæontologiske applikationer 4. I udviklingen er biomekaniske kræfter kendt for at optræde som en stimulus i mange celler til at aktivere celle responser 5-8, og det er nyttigt at forudsige både de relative positioner og størrelser af mekaniske stimuli med udvikling organsystemer, men i øjeblikket FE modellering har været lidt brugt for zebrafisk udvikling.
Både brusk og knogle er blevet vist at være mekanosensitive materialer. For eksempel har in vitro kompression vist sig at aktivere chondrogene veje, mens spændingen er blevet vist at være nødvendig for knogledannelse 9. FE-analyse (FEA) er blevet udnyttet til at modellere stammer handler på biologiske prøver, herunder dem, der handler på skelet elementer under knogle foin ger 10. Andre udvikling applikationer omfatte dets anvendelse til at forudsige form af en fælles, efter at den har været udsat for teoretiske biomekaniske kræfter 11,12 og for at vise mønstret af stammer stede under chick knæleddet morfogenese 8.
Denne protokol er rettet mod at dele oplevelsen af at generere 3-dimensionelle overflader, masker og Finite Element-modeller fra konfokale billeder med henblik på at forstå mekanikken i udviklingslandene væv. Vi viser også måder at validere FE modellerne selv fange ægte fælles forskydning information in vivo. Mens vi bruger zebrafisk kæbe som forbillede de samme teknikker kan bruges på enhver lille biologisk system, som kan fås 3D oplysninger om strukturen af bevægeapparatet ved konfokal eller multifoton billeddannelse.
Finite element modeller er blevet anvendt til at relatere områderne skelet elementer, der er under pres med dem, der gennemgår knogledannelse 10, samt at kortlægge de områder under belastning under endochondral ossifikation og fælles morfogenese 8,12,21. Andre undersøgelser har også været i stand til at anvende teoretiske vækstmodeller at kopiere forandringer under fælles udvikling 11,12. Her viser vi protokollen for at bygge FE modeller for et relativt simpelt system, zebrafisk kæbe 20. I modsætning til alternative metoder til indsamling rå billeder til FE modeller, såsom CT-scanning 22, konfokal billeddannelse af transgene linjer eller immunfarvet zebrafisk giver mulighed for flere væv, der skal undersøges. Det kan derfor give direkte oplysninger om muskel fastgørelsespunkter i forhold til brusk. Blandt hvirveldyr modeller zebrafisk er særligt modtagelige for genetisk og farmakologisk manipulation. Frembringelsen af FE modeller til zebrafiskkraniofaciale brusk åbner nu op for muligheden for yderligere undersøgelse af samspillet mellem biomekanik og genetik i fælles morfogenese.
Der er en række kritiske trin til processen med at skabe en FE-model; den første er at generere en korrekt tredimensional repræsentation af systemet. Det kræver billedbehandling ved høj nok opløsning til klart at definere grænser. Bemærk, at selv med høj opløsning billeddannelse at gøre en god overflade man kan have at udglatte nogle regioner. Et andet kritisk trin er at definere den korrekte placering af lasten og korrekte begrænsninger. En utilstrækkeligt begrænset model vil undlade at løse og forkert placering af belastningerne vil forårsage unormal bevægelse.
Nogle behandling af de rå data (figur 2) er nødvendig som en overflade genereret fra de rå data ville være vanskeligt at mesh (figur 2B). Vi filtrerede data ved hjælp af en Gaussisk filter (figur 2C </sTrong>), og vi foretaget nogle manuelle udglatning af kurverne til at producere et sæt rene linjer, der kan konverteres til en 3D-overflade. For meget udjævning kan producere en "smeltet" overflade, der har mistet mange af sine funktioner. Valg af den korrekte element størrelse er en iterativ proces som at vælge for lille et element størrelse skaber for stor en maske, som er beregningsmæssigt intensive. vælger for stor et element størrelse, vil imidlertid frembringe et net, som undlader at rekapitulere den korrekte form af strukturen. Den korrekte maske havde den mindste element størrelse, der erobrede den rigtige form af kæben og konvergeret på en korrekt løsning, kontrolleres ved hjælp kæben forskydning. Det kan også være nødvendigt at ændre materialeegenskaberne eller lastberegninger bedre efterligne den korrekte forskydning som forskellige aldre og arter vil have væsentligt forskellige egenskaber.
Det er vigtigt at huske, at der altid er begrænsninger for en hypotetisk model og enAntagelser til at køre FE modeller. Når kun modellering ét eller et lille antal prøver er det vigtigt at sikre, at en repræsentativ prøve er valgt som der sandsynligvis vil være små variationer mellem individer. Da kun nogle af kæben elementer og muskler blev medtaget, modellen er en forenklet version af zebrafisk kraniofaciale bevægeapparatet. Derfor begrænsninger måtte positioneret til at redegøre for, hvor de modellerede kæbe elementer ville forbinde med resten af kraniet og modellen blev kunstigt begrænset i midten til at ordne det i 'rum'. Denne kunstige begrænsning påvirkede ikke om fortolkningen trukket fra modellerne som ceratohyal selv ikke blev analyseret. Inklusionen af flere af kraniofacial struktur, kunne især andre kæbe åbning muskler såsom sternohyals og dens vedhæftede brusk 23, have tilføjet til modellen, men begrænsninger omfatter evnen til større modeller til at køre i Finite Element-softwaren.
<p clas s = "jove_content"> En anden begrænsning er, at vi ikke har modelleret ligament insertion, selv om dette kan opnås ved indsættelse af fjedrene 8. En anden antagelse i dette tilfælde var at modellen ville opføre sig lineært. Størrelserne af pres på modellerne var sammenlignelige med dem i offentliggjorte modeller og anvendt til in vitro-celler 10,24, med stammer er under 3500 og over -5000 μɛ bortset fra tvang og muskel fastgørelsespunkter. Derfor blev stammerne på de berørte dele af modellen vurderes inden for et interval acceptabelt for en lineær model. Brusk ikke opfører sig helt som en lineær materiale og er tidligere blevet modelleret som en poroelastic materiale, som gjorde det muligt analyse af fluidet adfærd i modellen 25. Spredning af muskel fastgøringspunkter blandt en klynge af lokale knudepunkter vil distribuere peak kræfter og mere præcist repræsenterer musklen indsættelse for visse muskler. ent "> Anvendelse af FE giver en vurdering af stammer og spændinger, der handler på en struktur. Som en teknik er det ofte bruges i mange biovidenskab discipliner, herunder ortopædi, palæontologi og for nylig udviklingsmæssige biologi. Her beskriver vi, hvordan man opbygger FEs for zebrafisk underkæbe. i fremtiden disse modeller kan udvides til at se på hele kæben, herunder ganen. Lignende teknikker kan anvendes til at modellere spinal biomekanik i fisk, som til dato har mest været studeret af bevægelige organer.The authors have nothing to disclose.
LHB blev finansieret af Wellcome Trust Dynamic Cell ph.d.; KAR blev finansieret af MRC projekttilskud MR / L002566 / 1 (tildelt EJR og CLH) og CLH blev finansieret af ARUK tilskud 19479. Vi vil også gerne takke Wolfson Bioimaging facilitet for imaging rådgivning.
Coll2 | Abcam | ab34712 | Type II collagen antibody – stains all cartilage |
A4.1025 / MF20 | Developmental studies hybridoma bank | A4.1025 | Skeletal mysoin antibody – marks all skeletal muscle |
Low melt agarose | Sigma | A9414-5G | For mounting zebrafish |
MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate ) | Sigma | E10521-10G | To make anaesthetic |
Trypsin | Fisher | T/3760/48 | sample permeablilisation |
Dylight 488Mouse IgG | Thermofisher | 35502 | Secondary antibody |
Dylight 550 Rabbit IgG | Thermofisher | 84541 | Secondary antibody |
SP8/SP5 or SPE confocal | Leica | For imaging | |
LAS Leica capture software | Leica | Imaging software | |
Aviso (version 7.0.0) | FEI Visualization Science Group | 3D image analysis software (Section 2) | |
Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10) | Altair Engineering | FE model generating software (Section 4-5) | |
Abaqus (version 6.14) | SIMULIA | FE analysis software (Section 5.7-5.8) |