Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
Fænotypisk karakterisering af systematiske mutant samlinger af modelorganismer er en gennemprøvet metode til dissekering cellulære kompleksitet. Den haploide encellede grønalger Chlamydomonas reinhardtii har et anlæg-lignende gen sæt, men det afveg fra landplanter, før flere genom gentagelser i landet plante afstamning 2. I princippet manglende gen overlapning og en hovedsagelig haploid livscyklus i høj grad letter tab-af-funktion genetiske tilgange. Men er næsten umuligt målrettet afbrydelse af gener af interesse på grund af manglen på en effektiv homolog genomisk integration. En tilfældig indførelsesmutationen forstyrrelser biblioteket er under opførelse, kombineret med identifikation af forstyrret site, hidtil hvilket giver en array sæt af 1.935 kortlagte forstyrrelser, der repræsenterer 1.562 gener 3. Men denne tilgang (forventet generelt at producere null mutationer) gælder ikke for væsentlige gener. Temperatur-følsomme (ts) mutationer kan recovered i essentielle gener, og de seneste metoder muliggør effektiv identifikation af det muterede gen og den forårsagende læsion. Fænotypisk analyse ved høj temperatur giver derefter øjeblikkelig information om funktionen af det muterede gen. Vi rapporteret om isolering og karakterisering af ts dødelige mutationer i ~ 70 essentielle gener i Chlamydomonas, især med fokus på gener involveret i cellecyklus progression og kontrollere 1,4.
Ts dødbringende skærme har været en grundpille i genetisk analyse i mikroorganismer i årtier 5,6. I princippet et ønskeligt træk er at nærme "mætning", hvilket betyder, at alle gener, der kan mutere til ts letalitet identificeres ved mindst en mutant, som tillader en fuldstændig analyse. Men i praksis, flere faktorer begrænser, tilgangen til mætning. Først, mens næsten alle gener kan muteret til tab af aktivitet ved høj temperatur, effektiviteten af udvinding af sådanne mutanter varierer over mindsten størrelsesorden 7,8. Derfor begynder en tilfældig skærm at afhente tilbagevendende hits i "frequent flyers" længe før mætning er kontaktet. For det andet, mens ts mutationer normalt resultere i reduktion af funktion, de kan ikke være sande nuller på en restriktiv temperatur (og omvendt, er ofte ikke fuldt funktionel ved en tolerant temperatur). Dette problem kan løses i et vist omfang ved at sammenligne flere alleler; hvis de alle deler en fælles fænotype, det er mere sandsynligt at afspejle resultatet af simpel inaktivering af genet. Flere alleler er også meget nyttigt for definitiv molekylær identifikation af den sygdomsfremkaldende læsion en. den "frequent flyer" problem betyder dog, at flere alleler i sjældent ramt gener kan være svært at komme sig.
Af disse grunde har vi udviklet en forbedret rørledning til at isolere og fænotypisk karakterisere ts mutanter. Vi har samlet over 3.000 ts mutanter hidtil, jegncluding omkring 200 nye kandidat cellecyklus mutationer. Molekylær og fænotypisk analyse af denne samling, som allerede sandsynligvis indeholder mutationer i de fleste eller alle celle-væsentlige veje, skal give ny indsigt og hypoteser i anlæg cellebiologi. Vigtigt er det, kan denne rørledning anvendes på enhver mikroorganisme, der vokser på agar til effektivt konstruere ts mutant samlinger.
Et notat om udstyr: to robotter er meget vigtige for effektivitet i denne procedure (en koloni picker og en kombination replika plater / cherry picker). Plukkerne har typisk metal ben. Plukkede kolonier holdes i luft på disse stifter til nogle periode (sekunder til minutter, afhængigt af modellen). Chlamydomonas dør i omkring 20 sek på en metal pind i luften. Dette begrænser model valg for organismen. Nøjagtighed spørgsmål. Vores koloni picker er rimelig præcis; Men det er lidt voldsom i sin indsats og har en vis mulighed for spray-baserede krydskontaminering. Den bruges ikke ved højis end 384 densitet (4,5 mm center-center); på denne tæthed, nøjagtigheden er helt acceptabelt. Replika plating / cherry picking robot (forskellige redskaber, der anvendes til disse applikationer) er meget langsommere på plukning, men er præcis nok til 1536 densitet (6144 er en udfordring, selv for denne meget præcise robot, vi har evalueret denne tæthed men valgte ikke at bruge den på grund af sine forskellige vanskeligheder). Robotten vil ikke fungere godt, hvis pladerne er indlæst ujævnt, osv. Det er vigtigt at få øje-check for at være sikker de rigtige ting sker; selvfølgelig vil robotten køre uden opsyn og i almindelighed, alt vil gå godt, hvis de første par plader var korrekte.
Den her beskrevne for højt udbytte isolering af ts dødelige mutanter rørledning sikrer, at formentlig alle cellulære-essentiel veje i Chlamydomonas genomet er repræsenteret. De to mest kritiske trin til effektiv opsamling af potentielle cellecyklus gener og til fjernelse af gentagne "frequent flyer" alleler er: 1) en sammenhængende definition af anholdelse fænotype egenskaber for ufuldstændige cellecyklus og 2) den parallelle komplementering assay mod allerede identificerede forespørge gener for at forstørre samlingen med nyligt isolerede dem.
Når synkroniseret af lys-mørke cyklus, Chlamydomonas vokser fotosyntetisk i dagtimerne og stigninger i cellestørrelse> 10x uden DNA-replikation eller celledeling 13. Tilnærmelsesvis sammenfaldende med indtræden af natten, celler undergår derefter flere cyklusser af alternerende DNA-replikation, mitose og celledeling (figur 8). Denne lovgivningsmæssige Scheme tilvejebringer en naturlig skelnen mellem gener primært nødvendige for cellevækst og integritet og gener nødvendige specielt til celledelingscyklussen. Vi fandt, at 10-timers og 20-timers tidspunkter er meget oplysende for en indledende ru fænotypisk cut 1. De brede klasser af ts dødelige mutanter, som vi genkender i øjeblikket, baseret på disse billeder (se SI i Tulin og Cross, 2014) 1, er: Notch, Popcorn, Round, Small, Medium, tidlig lyse, og flere cyklus (figur 8 ).
De tre mest relevante kategorier, vi fokuserer på, er Notch, Popcorn, og runden. De "Notch" og "Popcorn" fænotyper blev vist tidligere at være karakteristisk for de fleste cellecyklus-specifikke læsioner (f.eks mitotisk cyklin-afhængige kinase, DNA-replikation maskiner, og topoisomerase II) 1. Fremkomsten af en (Notch) eller flere (Popcorn) tilsyneladende planer af begyndende men forgæves celledeling er en bekvem Morphological indikator for cellecyklus indvielse. Disse mutanter udviser generelt få eller ingen vækstdefekter med stigninger i cellevolumen ligner WT i 10-timers mærket. Kærven og Popcorn fænotyper er tydelig ved 10 timer og er fuldt udviklede (ofte forbundet med cellelyse) ved 20 timer. "Runde" celler vokser på samme måde som WT men med meget reduceret produktion af tilsyneladende begyndende division fly, hvilket således giver store, runde standsede celler. Tidligere mutanter i denne kategori er faldet i komponenter i anafase-fremmende kompleks 14 eller i gener, der er nødvendige for mikrotubuli funktion (tubulin-foldning cofaktorer, gamma-tubulin ring kompleks) 1. På senere tidspunkter, disse celler ofte udviser udtalt cellelysis.
"Small" og "middel" celler vokser enten ubetydeligt (Small) eller betydeligt mindre end WT (Medium). Mange af disse mutanter identificeret til dato har læsioner i gener, hvis anmærkninger tyder roller i grundlæggende cellular vækst processer (oversættelse eller membran biogenese). Den vigtigste mikroskopiske forskelsbehandling mellem Medium og Round hviler på mængden af vækst på 10 timer (Round: ligesom WT; Medium: reduceret). Fordi Små og mellemstore kategorier er ret store og sandsynligvis afspejler læsioner i et stort udvalg af cellulære veje, er vi ikke forsøger at mætte disse kategorier; Men ønsker vi at molekylært identificere repræsentanter fra klassen til at forstå fænotyper af tab i forskellige veje. To unstudied kategorier er: 1) den tidlige lyse af mutanter, der mister integritet (tab af grøn farve, tab af refraktilitet) med 10-timers-mærket, med få tegn på vækst forudgående celle og 2) de mange cykler. Prolifererer på samme måde som Wt ved 10 og 20 timer, selvom de udviser en fuldstændig manglende evne til at udføre langsigtet proliferation.
Vi er for det meste karakteriserer "hak", "popcorn" og "runde" og udelukke små og mellemstore runde celler, samtsom utætte mutanter at komplette par celledelinger. Dette er primært at sikre, at grundlæggende cellulære funktioner, såsom vækst og membran integritet, er funktionelle og berige sandsynligheden for divisionens-relaterede gener. Denne fremgangsmåde viser sig at være empirisk effektive; kan det imidlertid være, at en cellecyklus genet er pleiotropisk og har yderligere roller tidligere i G1, før egentlig division. Sådanne sager, som vi forventer at være sjældne, er savnet. Mere generelt, sigter vi for homogen anholdelse, hvilket i høj sandsynlighed skyldes en sygdomsfremkaldende mutation, som er en helt dysfunktionel protein. Men af samme grund som netop beskrevet, der kan være flere anholdelse point og derfor en vis fleksibilitet er tilrådeligt i valget kandidater.
For at berige samlingen med nyligt identificerede gener, er de valgte kandidater analyseret for komplementering. Vi kræver TS i den positive kontrol (forespørgsel mod forespørgsel mutation) og ts + i den negative kontrol (querå mod WT). Nye mutanter i samme komplementeringsgruppe som forespørgslen er TS. Medlemskab i samme komplementeringsgruppe næsten altid afspejler en molekylær læsion i det samme gen (dette har været tilfældet for enhver sådant gen vi har testet). Derfor, for "frequent flyers", dette kriterium er ekskluderende for yderligere karakterisering. Mutanter, der ikke var på samme komplementeringsgrupper grupper som de testede forespørgsler er kandidater til nye gener og er yderligere karakteriseret ved bioinformatik og eksperimentelle værktøjer. Meget varierende genvinding af TS- alleler i forskellige komplementeringsgrupper grupper er et velkendt fænomen, det vil sige, variabilitet er markant større end Poisson støj, grundet den store iboende variabilitet af foranderlighed til TS- mellem forskellige gener. Årsager kunne omfatte iboende termolabilitet forskelle; forskellige protein størrelser; tilstedeværelsen af et protein som en monomer versus som en stor, stabiliseret kompleks; og mutagene hot spots. Dette er næsten en ren nuisance. , En resulterende positive resultat er imidlertid, at den "frequent flyer" liste er ikke længe (med kun et par mål, besætter det meste af listen), så arbejdskrævende komplementering test er ikke en massiv virksomhed, indtil de senere faser af projektet.
Som en tilgang, udførte vi en binding assay. I dette assay er dobbelt-resistente afkom udvalgt og testes for TS fænotype. En TS fænotype forventes (og observeret) for mutanter i samme komplementeringsgruppe som forespørgslen eller for tæt knyttet mutationer. For hver af de testede gener, forventes en WT afkom skal vises (ts + fænotype) i en vis sandsynlighed afhængigt af genetiske afstand. Vi vurderer, at der er omkring 100 zygospores for hver parring i disse pletter. Under forudsætning af 100% meiotisk effektivitet, vil dette resultere i omkring 100 dobbelt-resistente afkom fra de tilkoblede lægemiddelresistens kassetter (25% af den meiotiske afkom, fire pr meiose, grundet Mendelian arv). Dette ville også være tilfældet for TS mutationer, hvor 25% af de afkom vil være dobbelt-mutant, og 25% vil være WT hvis forespørgslen og test mutationer er sammenkædet. Derfor ud af dobbelt-resistente afkom, vil 25% være WT (omkring 25 celler). Dette er tilfældet for helt tilkoblede mutationer; dog vil moderat binding (inden ~ 20 cm, ca. 2 Mb, eller 2% af genomet 115) kraftigt reducere eller eliminere ts + signal. I tilfælde af binding af den testede mutation for antibiotikummet kassette, ts + haploider som er dobbelt-resistente forefindes i meget lave mængder. Dette manifesterer sig som tilsyneladende manglende rekombinere med alle testede mutanter, på trods af at supplere alle mutanter testet, en afvigende resultat, der er let bemærket; i sådanne tilfælde vil tilbagekrydsning løse problemet.
Både fra forudgående kendskab og fra sekvensanalyse, forventer vi cellecyklus gener i Chlamydomonas at være omkring 500 gener 2, selv om most, men sandsynligvis ikke alle, er afgørende. Vi vil vurdere nødvendigheden af yderligere mutagenese-runder som flere mutanter indsamles og mætningsniveauet stiger.
Denne procedure er unikt designet til at studere fundamentale biologiske processer og de gener og proteiner, der fører dem ud. Andre metoder til at generere forstyrrelser i essentielle gener eksisterer (fx transformation af tilfældigt mutageniserede alleler 16, betinget transskriberede alleler 17 eller hypomorphic alleler 18). Men de alle kræver homolog rekombination, som er stærkt undertrykt i vegetativ Chlamydomonas. Den klynger, regelmæssigt indbyrdes afstand kort palindromiske gentagelse (CRISPR) / Cas9 systemet er blevet etableret som et effektivt værktøj til gen-modifikation 19; det er imidlertid endnu at arbejde effektivt i Chlamydomonas 20. Kritisk, alle disse metoder kræver forudgående kendskab til målet. Dette er en alvorlig begrænsninghvis man ønsker at have mulighed for at lære noget nyt! Vores tilgang vil give mutationer identificerer væsentlige gener, uafhængige af nogen forudgående viden. Derfor på det nuværende niveau af teknologi, kan isolering af tilfældige ts mutationer efterfulgt af gen-identifikation af dyb sekventering være den mest effektive metode til at få hurtig adgang til mikrobiel cellebiologi i anlægget superkingdom.
Identifikation af sygdomsfremkaldende mutationer (blandt ~ 100 kodning-sekvens skiftende mutationer i hver klon) er uden for rammerne af dette papir. Deep sekventering af bulked segregant pools 1 er effektiv, men arbejdskrævende. En kombinatorisk pool strategi til bestemmelse af alle mutationer i et stort antal stammer, efter sekventering af et lille antal puljer, er meget omkostnings- og arbejdskrævende effektiv. En ny strategi for kombinatorisk bulked segregant sekventering er under udvikling, som vil gøre det muligt at identificere sygdomsfremkaldende mutationer i snesevis af mutanter simultaneously i en enkelt sekventering run (under forberedelse). Disse effektivitetsgevinster er meget vigtigt at give den kritiske gen identifikation skridt for at holde trit med den meget hurtig ophobning af mutanter, der er muliggjort af de procedurer, der er beskrevet her.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cross lab medlemmer for råd og nyttig diskussion. Dette arbejde blev støttet af PHS 5RO1-GM078153 og ved en Junior Fellow pris fra Simons Foundation til Michal Breker.
Equipment: | |||
Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |