前臨床マウスモデルのための外科手術手順および方法論<em>デ・ノヴォ</em>乳がん転移
Summary
乳癌の転移を標的としたアジュバント療法を評価する前臨床モデルは欠けている。これに対処するために、本発明者らは、アジュバント設定（原発腫瘍の外科的切除後）で投与された治療が、以前に播種された肺転移に影響を及ぼす有効性について評価され得る、 新規な肺乳腺腺癌転移のマウスモデルを開発した。
Abstract
A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study end-points. Thus, studies focused on elucidating mechanisms of late-stage de novo metastasis are compromised, as are studies examining efficacy of anti-cancer therapies targeting mediators of metastasis in the adjuvant setting. Numerous murine mammary cancer models have been developed via targeted expression of dominant oncoproteins to mammary epithelial cells yielding models variably mimicking histopathologic and transcriptome-defined breast cancer subtypes common in women1. While much has been learned regarding the biology of mammary carcinogenesis with these models, their utility in identifying molecules regulating growth of late-stage metastasis are compromised as mice are typically euthanized at earlier time points due to significant primary tumor burden. Moreover, since a significant percentage of women diagnosed with breast cancer receive adjuvant therapy after surgical resection of primary tumors and prior to presence of detectable metastatic disease, preclinical models of de novo metastasis are urgently needed as platforms to evaluate new therapies aimed at targeting metastatic foci. To address these deficiencies, we developed a murine model of de novo mammary cancer metastasis, wherein primary mammary tumors are surgically resected, and metastatic foci subsequently develop over a 115 day post-surgical period. This long latency provides a tractable model to identify functionally significant regulators of metastatic progression in mice lacking primary tumor, as well as a model to evaluate preclinical therapeutic efficacy of agents aimed at blocking functionally significant molecules aiding metastatic tumor survival and growth.
Introduction
北アメリカの女性は、乳がん2を発症する生涯リスクが〜12％です。これらの個体の大多数は、手術により摘出された原発腫瘍を有し、がんサブタイプに応じて、アジュバント設定3で標的、内分泌、化学療法および/または放射線療法を受ける。何の標的療法は、トリプルネガティブ腫瘍の3のためにまだ利用できないのに対し、例としては、放射線/化学療法とHER2標的治療を受けたHER2陽性腫瘍を抗エストロゲン療法と女性を受けるホルモン受容体陽性癌と診断された女性が含まれます。外科的切除を補完する放射線、化学療法、パーソナライズされたホルモン療法の進歩にもかかわらず、病気はステージIIまたはIIIの病気と診断された女性の30〜70％で再発する4 、遠隔臓器における転移性疾患の根絶には効果がほとんどない肺、骨、b雨および/または肝臓5 。これは、転移性疾患が原発腫瘍再増殖の不在下で起こる場合、これは、播種性悪性細胞が確定手術の時点で二次臓器にすでに存在している可能性があることを意味するので、特に重要である。したがって、転移性腫瘍の根絶または緩徐化が可能な治療法が急務である。
乳腺発がんの新規のマウスモデルは、腫瘍性の進行1を制御するメカニズムを明らかに著しく有益であったが、既存のモデルにもいくつかの制限があります。これらのうちの1つは、 新規のトランスジェニックモデルが典型的には、原発腫瘍負荷が研究の期間を制限する複数の乳腺において原発腫瘍を発症するという事実である。原発腫瘍細胞の逃避および転移播種は、これらのモデルにおける新生物の進行の早期に起こる可能性が高いが、転移性腫瘍の率直な発達は遅く起こり、マウスモデルと株のバックグラウンドは、しばしば部分的に浸透している1 。これは、二次器官における転移を制御する分子の発見のための新規モデルの有用性をさらに制限し、アジュバント設定における治療薬の臨床前の有効性を評価するためにさらに制限する。
これらの制限を回避するために、我々は、肺への乳癌の転移の新たな土着モデルを開発しました。後期デノボ乳腺腫瘍を担持（FVB / N本明細書に記載の研究のための株バックグラウンドで、すなわち 、MMTV-PyMT）親トランスジェニック雌は〜100日6歳であり、それらの原発腫瘍をその時点で外科的に切除し、酵素的に解離されています単一細胞懸濁液。単一の原発性乳腺腫瘍が38〜60日の期間に亘って発生する6〜7週齢のレシピエント同系雌性マウスに懸濁液（1×10 6細胞）を順化させる<strong class = "xfig">図1A）。定義された腫瘍サイズ（172〜450mm 3 ）で、レシピエントマウスを麻酔し、原発腫瘍を外科的切除して、外科手術部位での腫瘍再増殖を最小限に抑え、女性の手術と一致させる（ 補足図1 ）。 FVB / n株のバックグラウンドでは、マウスは手術後約115日までに45％の浸透率を有する肺で組織学的に検出可能な転移病巣を発症する（ 図1B ）。転移腫瘍増殖の延長された潜伏期間により、このモデルは、補助的治療の送達、および原発腫瘍の外科的除去後の転移性進行に影響を及ぼす基礎となる生物学の解明および評価のために独特に位置付けられる。
Protocol
Representative Results
Discussion
変更とトラブルシューティング：
鈍的な腫瘍を腹壁から摘出するとき、腫瘍は腹壁に付着したままである可能性がある。これは腫瘍を注射したマウスの5％未満で観察された（データは示さず）。腹壁に付着した腫瘍を有するマウスの場合、原発腫瘍の再増殖なしには切除が困難であるため、マウスを安楽死させるべきである。
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、組織病理学的支援のためのジョー・ヒル、手術技法指導のジョン・グリースティン博士、ビデオ撮影支援のためのテッサ・ダイエル、重要な洞察と議論のためのウォン・クーセンズ研究所の全メンバー、財政支援のためのOHSU騎士癌研究所に感謝する。著者らは、TEGGM071388-10およびT32CA106195-11からCEG、NCI / NIH、国防乳癌研究プログラム、スーザンGコメン財団、乳がん研究財団、およびスタンドアップトゥーガン – ラスガルテン財団への支援を認めている膵臓癌コンバージェンスドリームチーム翻訳研究グラント（SU2C-AACR-DT14-14）を、LWMC、女性ヘルス・サークル・オブ・ヘルス・ファンデーション・オブ・ヘルス・グラント、MHWおよびLMCに対するBrenden-Colson膵臓ヘルス・センターに寄贈しました。
Materials
| Isofluorane | Piramal Healthcare | N/A | Prescription order |
| Collagenase A | Roche | 11088793001 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| DMEM | ThermoFisher | 12634010 | |
| 25 mL Pyrex bottle | Sigma-Aldrich | CLS139525 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Bio | S11150 | |
| 0.7 µm nylon strainer | Corning | 352350 | |
| 50 mL conical tube | VWR | 89039-658 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD | 354230 | Growth factor-reduced solubilized basement membrane preparation extracted from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma |
| Poly(vinylpyrrolidone)–Iodine complex | Sigma-Aldrich | PVP1 | |
| 29 gauge 0.3 mL insulin syringe | BD | 324702 | |
| Small Vessel Cauterizer Kit | FST | 18000-00 | |
| Wound clips | Texas Scientific | 205016 | |
| AutoClip wound clip applier | BD | 427630 | |
| AutoClip wound clip remover | BD | 427637 | |
| Bromodeoxyuridine | Roche | 10280879 | |
| Heparinized capillary tubes | Fisher | 22362566 | |
| Microtainer tubes with dipotassium EDTA | BD | 365974 | |
| 20 mL syringe | BD | 309661 | |
| DPBS | Thermo-Fisher | 14190-250 | |
| OCT-freezing medium | VWR | 25608930 | |
| Formalin, Buffered, 10% (Phosphate Buffer) | Fisher | SF100-4 | |
| 23g needle | Fisher | 14-826-6B | |
| FVB/n mouse | Jackson Laboratories | 001800 |
References
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