اقترانية التزاوج فحوصات لتحليل تسلسل محدد من البروتينات نقل تشارك في الإقتران البكتيرية
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
نقل الجينات والبروتينات على المستوى الجزئي العضوي يلعب دورا مركزيا في بقاء البكتيريا وتطورها وكذلك عمليات العدوى. تبادل الحمض النووي بين البكتيريا أو بين البكتيريا والخلايا لا يمكن أن يتحقق من خلال التحول، والاقتران أو ناقلات التنبيغ. 1،2 الإقتران هي فريدة من نوعها بالمقارنة مع التحول والتنبيغ في ذلك خلال الاقتران بين البكتيريا سالبة الجرام مثل كولاي، يحدث نقل الحمض النووي بطريقة تسيطر عليها المانحة حيث يربط نظام الجزيئات المعقدة خلايا المانحة والمتلقية. الإقتران هي أيضا الطريقة الأكثر مباشرة التي الخلايا البكتيرية تتفاعل مع الخلايا المضيفة لحقن الجينات والبروتينات أو المواد الكيميائية في لأنظمة المضيف. 3 وفي كثير من الأحيان، ونقل هذه العوامل له تأثيرات ملحوظة على المضيف، تتراوح بين التسبب والتسرطن لاستضافة التطور والتكيف. وقد تبين أن recombinatio اقترانيةن يزيد من معدل التكيف 3 أضعاف في البكتيريا مع معدلات طفرة عالية في ظل ظروف الإجهاد البيئي. 4 وعلاوة على ذلك، الاقتران هو إلى حد بعيد الطريقة الأكثر شيوعا التي يتم من خلالها نشر الجينات المقاومة للمضادات الحيوية في السلالات البكتيرية. 5،6
وقد تطورت الكائنات الحية الدقيقة إفراز نظم متخصصة لدعم نقل الجزيئات عبر الأغشية الخلوية. يوجد حاليا 9 أنواع من أنظمة إفراز (TSSs) في البكتيريا سالبة الجرام التي تم وصفها: T1SS، T2SS، T3SS، T4SS، T5SS، T6SS، T7SS، وكذلك المجلس الأعلى للتعليم (إفراز) وتات (يومين أرجينين النبات) مسارات. 7،8 لكل نوع من نظام إفراز ينقسم الى مزيد من أنواع فرعية مختلفة، ضرورة بسبب تنوع البروتينات وتميز الممرات المشتركة، في السلالات البكتيرية المختلفة. على سبيل المثال، في نظام النوع الرابع إفراز (T4SS)، وأنظمة تي والمساعدة النقدية تسهل نقل المستجيب في حين أن F-البلازميد، R27 لالثانية pKM101 T4SSs تسهيل نقل البلازميد اقترانية. 7،9،10 الفهم المفصل من الآليات التي الكائنات تجميع أنظمة إفراز كل منهما من البروتينات المكونة لها وتشترك محتويات الخلوية مع المتلقي أو البيئة المحيطة بهم هو عامل مهم في تطوير استراتيجيات ترمي إلى مكافحة الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض والعمليات عدوى الخلوي.
بعد تحديد الاقتران البكتيري الأولي في كولاي التي كتبها دربيرج وتاتوم، 11 وقد تم تحديد عدد كبير من البلازميدات النقالة واقترانية ويتميز. تظهر هذه البلازميدات 12 المتنقلة مجموعة كبيرة هو حجم (من 1 إلى أكثر من 200 kilobases (كيلوبايت))، ولكن كل البلازميدات النقالة تحتوي على relaxase، الذي يعترف أصل نقل (أوريت) وبالتالي تمكين انتقال البلازميد. البلازميدات اقترانية مزيد من جينات ترميز لتجميع وT4SS وظيفية وكذلك نوعرابعا البروتين اقتران. 12 على سبيل المثال 100 كيلو بايت F البلازميد كولاي بترميز كل الجينات اقترانية ضمن (هيئة تنظيم الاتصالات) المنطقة 33.3 نقل كيلوبايت. 13 الجينات في المنطقة هيئة تنظيم الاتصالات البلازميد ترميز F جميع البروتينات التي تسهل تشكيل شعرة، التزاوج تشكيل الزوج (MPF)، نقل الحمض النووي وظائف استبعاد أثناء نقل البلازميد اقترانية. 10،14،15 مجموعة كبيرة من المعرفة متاحة للاقترانية T4SSs، ومع ذلك بالتفصيل الدراسات الهيكلية للبروتينات اقترانية والمجمعات وإلا أصبحت متاحة في الآونة الأخيرة. 16-28
من أجل تجميع عرض شامل لعملية اقترانية، لا بد من اقتران دراسات هيكلية مفصلة لالطفرات تحليل البروتينات نقل اقترانية. ويمكن تحقيق ذلك من خلال فحوصات التزاوج اقترانية. لالبلازميد F، كل البروتين المشفرة في المنطقة هيئة تنظيم الاتصالات تلعب دورا في التعاون بوساطة F-njugation. وبالتالي، فإن خروج المغلوب / حذف الجينات نقل تلغي قدرة اقترانية الخلية (الشكل 1). في حين البلازميدات المحمولة الصغيرة هي أكثر ملاءمة لإجراءات الحذف القياسية، لالبلازميدات اقترانية أكبر مثل F، تتحقق بالضربة القاضية جين بسهولة أكبر عبر إعادة التركيب مثلي حيث يتم استبدال الجينات المستهدفة مع واحد نقل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية واضح. في البروتوكول الحالي، ونحن توظيف إعادة التركيب مثلي لاستبدال الجينات نقل الفائدة مع أسيتيل الكلورامفينيكول (CAT) في 55 كيلوبايت F البلازميد مشتق pOX38-ح. 29،30 البلازميد خروج المغلوب الناتجة، pOX38-ح Δgene :: سم، ويسهل المقاومة إلى وجود الكلورامفينيكول (سم) في وسائل الإعلام نمو. الخلايا المانحة إيواء pOX38-ح Δgene :: سم غير قادرة على التأثير اقترانية نقل الحمض النووي / التزاوج كما لوحظ من خلال استخدام فحص التزاوج. كفاءة التزاوج من خلية المانحة pOX38-ح Δgene :: سم ورجب الطبيعيient سينخفض أو، في كثير من الأحيان، أن يلغى. نقل اقترانية من البلازميد pOX38-ح Δgene :: سم يمكن استعادتها عن طريق البلازميد الانتعاش صغير إيواء الجينات نقل المستهدفة. هذا البلازميد الانتعاش يمكن أن يكون واحد أن يوفر التعبير التأسيسي، مثل pK184 البلازميد (pK184 الجينات)، 31 أو أخرى توفر التعبير محرض طالما أن البلازميد يستهدف بشكل صحيح الجين إلى الموقع الصحيح داخل الخلية (السيتوبلازم أو الجبلة المحيطية). ونتيجة لذلك، في المقايسات التزاوج بين هذه الجهات المانحة الجديدة (إيواء pOX38-ح Δgene البلازميدات :: سم + pK184 الجينات) والخلية المستقبلة، ومن المتوقع أن يعيد إلى ما يقرب من ذلك من الطبيعي المانح والمتلقي التزاوج فحص كفاءة التزاوج. هذا النظام يمكن واحد للتحقيق وظيفة الجين خرج من خلال توليد سلسلة من يبني pK184 الجينات (الحذف أو طفرات نقطة) واختبار قدرة كل بناء لاستعادة القدرة التزاوج من إيواء pOX38-ح Δgene :: سم الخلية المانحةالصورة.
Protocol
Representative Results
Discussion
توفر عملية الاقتران البكتيري الوسائل التي يمكن للبكتيريا تنتشر الجينات توفير ميزة تطورية للنمو في البيئات الصعبة، مثل انتشار علامات مقاومة للمضادات الحيوية. لأن الكثير من البلازميدات اقترانية هي كبيرة جدا، 12 دراسة وظيفية على البروتينات المشاركة في تجميع جها…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل منحة ديسكفري من العلوم والهندسة مجلس الطبيعية في كندا (NSERC).
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
References
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
- Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
- Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
- Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).
