Conjugatif Mating Assays pour l'analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
Le transfert de gènes et de protéines au niveau des micro-organismal joue un rôle central dans la survie des bactéries et de l'évolution ainsi que les processus d'infection. L'échange d'ADN entre les bactéries ou entre une bactérie et une cellule peut être obtenue par transformation, conjugaison ou transduction du vecteur. 1,2 Conjugaison est unique en comparaison à la transformation et la transduction en ce que pendant la conjugaison entre les bactéries Gram-négatives telles que Escherichia coli, le transfert d'ADN a lieu de façon contrôlée du donneur dans lequel un système complexe macromoléculaire relie les cellules du donneur et du receveur. Conjugaison est aussi le moyen le plus direct dans lequel les cellules bactériennes interagissent avec les cellules hôtes pour injecter des gènes, des protéines ou des produits chimiques pour les systèmes hôtes. 3 Très souvent, le transfert de ces agents a des effets remarquables sur l'hôte, allant de la pathogenèse et la carcinogenèse d'accueillir l' évolution et l' adaptation. Il a été démontré que recombinatio conjugatifn augmente le taux d'adaptation de 3 fois dans les bactéries avec des taux de mutation élevés dans des conditions de stress environnemental. 4 En outre, la conjugaison est de loin la voie la plus commune à travers laquelle les gènes de résistance aux antibiotiques dans les souches bactériennes sont réparties. 5,6
Les micro-organismes ont développé des systèmes de sécrétion spécialisés pour soutenir le transfert de macromolécules à travers les membranes cellulaires; il y a actuellement 9 types de systèmes de sécrétion (TSSS) dans les bactéries Gram négatives qui ont été décrites: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, ainsi que le Sec (sécrétion) et Tat (deux-arginine translocation) voies. 7,8 Chaque type de système de sécrétion est divisé en différents sous – types, une nécessité en raison de la diversité des protéines et la spécificité des voies impliquées dans différentes souches bactériennes. Par exemple, dans le système de sécrétion de type IV (T4SS), les systèmes Ti et Cag facilitent le transport effecteur tandis que le F-plasmide, un R27nd pKM101 T4SSs faciliter le transfert d'un plasmide conjugatif. 7,9,10 Une compréhension détaillée des mécanismes par lesquels les organismes assemblent leurs systèmes de sécrétion respectifs de leurs protéines et composants partagent contenu cellulaire avec un destinataire ou leur environnement est un facteur important dans le développement de stratégies ciblées pour lutter contre les micro – organismes et les processus de pathogènes infection cellulaire.
Suite à la conjugaison bactérienne initiale d'identification dans E. coli par Lederberg et Tatum, 11 un grand nombre de plasmides conjugatifs et mobiles ont été identifiés et caractérisés. 12 Ces plasmides mobiles montrent gamme considérable est la taille (de 1 à plus de 200 kilobases (kb)), mais tous les plasmides mobiles contiennent un relaxase, qui reconnaît l'origine du transfert (ORIT) permettant ainsi la transmission du plasmide. les plasmides conjugatifs autres gènes codent pour l'assemblage d'un T4SS fonctionnel ainsi que d'un typeIV protéine de couplage. 12 Par exemple , le F 100 kb du plasmide de E. coli code pour l' ensemble des gènes conjugatifs dans une région 33,3 kB de transfert (tra). 13 Les gènes de la région tra du plasmide F encode les protéines qui facilitent la formation de pili, l' accouplement formation de paires (MPF), le transfert de l' ADN et des fonctions d'exclusion pendant le transfert du plasmide conjugatif. 10,14,15 Un important corpus de connaissances est disponible pour conjugatif T4SSs, cependant détaillé des études structurales des protéines et des complexes de conjugaison ne sont plus récemment devenues disponibles. 16-28
Pour assembler une vue d'ensemble du processus de conjugaison, un couplage des études structurales détaillées mutationnelle analyses de protéines de transfert de conjugaison est nécessaire. Ceci peut être réalisé grâce à des essais d'accouplement de conjugaison. Pour le plasmide F, chaque protéine codée dans la région de tra joue un rôle dans la co F médiationnjugation; par conséquent, le knock – out / suppression d'un gène de transfert abolira la capacité de conjugaison de la cellule (Figure 1). Tandis que les petits plasmides mobiles sont plus propices à la procédure d'effacement standard, pour les plasmides de conjugaison plus grandes telles que F, knock-out de gène sont plus facilement atteints par l'intermédiaire d'une recombinaison homologue dans laquelle le gène cible est remplacée par une transporter un gène de résistance aux antibiotiques distincts. Dans le protocole actuel, nous employons la recombinaison homologue pour remplacer un gène de transfert d'intérêt avec le chloramphénicol acétyltransférase (CAT) dans le 55 kb F plasmide dérivé pOX38-Tc; 29,30 plasmide résultant knock-out, pOX38-Tc :: cm Δgene facilite la résistance à la présence de chloramphénicol (Cm) dans les milieux de croissance. Les cellules donneuses qui hébergent pOX38-Tc :: cm sont Δgene incapable d'affecter le transfert d'ADN par conjugaison / accouplement comme observé par l'utilisation d'un essai d'accouplement; l'efficacité de l'accouplement d'une cellule donneuse pOX38-Tc :: Δgene cm et une normale recipient diminuera ou, plus souvent, être aboli. transfert conjugatif du pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmidique peut être restauré par un petit plasmide de récupération hébergeant le gène de transfert ciblé. Ce plasmide de récupération peut être celle qui fournit une expression constitutive, tels que le plasmide pK184 (pK184 gène), 31 ou qui fournit une expression inductible tant que ce plasmide cible correctement le gène à l'emplacement approprié dans la cellule (cytoplasme ou le périplasme). Par conséquent, dans des essais d'accouplement entre ce nouveau donneur (hébergeant pOX38-Tc Δgene plasmides :: Cm + pK184 gène) et une cellule receveuse, l'efficacité de l'accouplement est prévu pour rendre à peu près celle d'un test d'appariement donneur-receveur normal. Ce système une permet de sonder la fonction du gène éliminé par la génération d'une série de constructions pK184 gène (délétions ou mutations ponctuelles) et en testant la capacité de chaque construction pour rétablir la capacité d'accouplement de la pOX38-Tc Δgene :: cm recel cellule donneuses.
Protocol
Representative Results
Discussion
processus de conjugaison bactérienne fournit un moyen par lequel les bactéries peuvent se propager des gènes offrant un avantage évolutif pour la croissance dans des environnements difficiles, tels que la propagation de marqueurs de résistance aux antibiotiques. Étant donné que la plupart des plasmides de conjugaison sont si grandes, 12 des études fonctionnelles sur les protéines impliquées dans l' assemblage du dispositif de transfert par mutation des gènes cibles sur le plasmide conjugatif se…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par une subvention à la découverte des sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG).
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
References
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
- Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
- Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
- Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).
