Method Article

Incelenmesi Protein Fonksiyonu, Spatiotemporal Yerelleştirme ve Protein Etkileşim Ağları için İndüklenebilir LAP-etiketli Kararlı Hücre Hatları

DOI:

10.3791/54870

⸱

December 24th, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of California, Los Angeles, 2Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 3Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein fonksiyonunu, uzay-zamansal hücre altı lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşim ağlarını araştırmak için lokalizasyon ve afinite saflaştırma (LAP) etiketli indüklenebilir kararlı hücre hatları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İzolasyonda hareket eden tek proteinler yerine çoklu protein kompleksleri, genellikle hücresel homeostazı düzenleyen moleküler yolları yönetir. Bu prensibe dayanarak, bu yolların işleyişi için gerekli olan kritik proteinlerin, doğal etkileşimli ortaklarıyla birlikte saflaştırılması, yalnızca bu yolların protein bileşenlerinin haritalanmasına izin vermekle kalmamış, aynı zamanda bu proteinlerin bu yolları düzenlemek için nasıl koordine edildiğine dair daha derin bir anlayış sağlamıştır. Bu bağlamda, bir proteinin uzay-zamansal lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşim ağını anlamak, bir yol içindeki rolünün yanı sıra yanlış düzenlenmesinin hastalık patogenezine nasıl yol açabileceğini tanımlamaya yardımcı olabilir. Bu ihtiyacı karşılamak için, tandem afinite saflaştırması (TAP) ve lokalizasyon ve afinite saflaştırması (LAP) gibi protein saflaştırması için çeşitli yaklaşımlar tasarlanmış ve başarıyla kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşımları yol ölçekli proteomik analizlere uygulamak için, bu stratejilerin klonlama ve memeli kararlı hücre hattı üretimindeki modern teknolojik gelişmelerle desteklenmesi gerekir. Burada, protein hücre altı lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşim ağlarını araştırmak için LAP etiketli insan kaynaklı kararlı hücre hatları oluşturmak için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, hücre bölünmesi de dahil olmak üzere çoklu hücresel yolların diseksiyonuna başarıyla uygulanmıştır ve yüksek verimli proteomik analizlerle uyumludur.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karakterize edilmemiş bir proteinin hücresel fonksiyonunu araştırmak için, in vivo uzay-zamansal hücre altı lokalizasyonunu ve etkileşen protein ortaklarını belirlemek önemlidir. Geleneksel olarak, ilgilenilen bir proteinin N veya C-terminaline kaynaşmış tek ve tandem epitop etiketleri, protein lokalizasyonu ve protein etkileşimi çalışmalarını kolaylaştırmak için kullanılmıştır. Örneğin, tandem afinite saflaştırma (TAP) teknolojisi, hem maya hem de memeli hücre hatlarında düşük miktarda bulunanlar da dahil olmak üzere doğal protein komplekslerinin izolasyonunu sağlamıştır1,2. Lokalizasyon ve afinite saflaştırma (LAP) teknolojisi, yeşil floresan proteinin (GFP) epitop etiketlerinden biri olarak eklenmesi yoluyla bir lokalizasyon bileşeni içerecek şekilde TAP prosedürünü değiştiren daha yeni bir gelişmedir3. Bu yaklaşım, araştırmacılara bir proteinin canlı hücrelerdeki hücre altı lokalizasyonu hakkında daha derin bir anlayış sağlarken, aynı zamanda protein-protein etkileşim ağlarını haritalamak için TAP karmaşık saflaştırmaları gerçekleştirme yeteneğini de korumuştur.

Ancak, TAP/LAP teknolojilerinin kullanımıyla ilgili birçok sorun vardır ve bu da bunların memeli hücrelerinde yaygın olarak kullanılmasını engellemiştir. Örneğin, ilgilenilen TAP / LAP etiketli bir proteini ifade eden kararlı bir hücre hattı oluşturmak için gerekli olan sürenin uzunluğu; bu tipik olarak ilgilenilen genin bir viral vektöre klonlanmasına ve istenen ekspresyon seviyesine sahip tek hücreli kararlı integrantların seçilmesine dayanır. Ek olarak, birçok hücresel yol, yapısal protein aşırı ekspresyonuna (düşük seviyelerde bile) duyarlıdır ve hücreleri durdurabilir veya zamanla hücre ölümünü tetikleyebilir, bu da bir TAP / LAP stabil hücre hattının oluşturulmasını imkansız hale getirir. Bu ve diğer kısıtlamalar, LAP/TAP metodolojilerinin protein lokalizasyonu ve protein kompleksi aydınlatması için yüksek verimli sistemler haline gelmesini engellemiştir. Bu nedenle, klonlama ve hücre hattı teknolojilerindeki mevcut yeniliklerden yararlanan memeli hücreleri için indüklenebilir yüksek verimli bir LAP etiketleme sisteminin geliştirilmesine büyük ilgi olmuştur.

Burada, hem klonlama hem de memeli hücre hattı teknolojilerindeki ilerlemeleri uygulayan, Doksisiklin/Tetrasiklin (Dox/Tet) ile indüklenebilir LAP etiketli proteinlerle kararlı hücre hatları oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, LAP etiketli protein hücre altı lokalizasyonu, protein kompleksi saflaştırması ve etkileşen proteinlerin tanımlanması ile ilgili verilerin elde edilmesini kolaylaştırır4. Afinite proteomikleri, protein kompleksi aydınlatması5 için çok çeşitli teknikler kullansa da, yaklaşımımız bu komplekslerin ve bunların doğal etkileşim ağlarının tanımlanmasını hızlandırmak için faydalıdır ve çok sayıda protein bileşeni içeren karmaşık biyolojik yolları araştırmak için gerekli olan yüksek verimli protein etiketlemesine uygundur. Bu yaklaşımın anahtarı, in vitro, bakteri ve bakulovirüs gibi çeşitli organizmalarda ve memeli hücrelerinde in vitro gen ekspresyonu için bir dizi vektöre hedef genlerin yüksek doğrulukta ve hızlandırılmış klonlanmasını sağlayan klonlama stratejilerindeki ilerlemelerdir6,7. Ek olarak, ORFeome işbirliği, bilimsel topluluk8-11'in kullanımına açık olan, klonlamadaki bu ilerlemeleri içeren vektörlerde binlerce dizi doğrulanmış açık okuma çerçevesini klonlamıştır. Sistemimizde, pGLAP1 LAP etiketleme vektörü, çok sayıda klonun aynı anda klonlanmasını sağlar ve bu da yüksek verimli LAP etiketlemeyi kolaylaştırır. Bu hızlandırılmış klonlama prosedürü, önceden belirlenmiş tek bir genomik lokusa eklenen LAP etiketli ilgilenilen genlerle hücre hatları oluşturmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşımla birleştirilmiştir. Bu, genomları içinde LAP etiketli genler için entegrasyon bölgesi olan tek bir flippas tanıma hedefi (FRT) bölgesi içeren hücre dizilerini kullanır. Bu hücre hatları aynı zamanda, LAP etiketli genlerin yukarı akışındaki Tet operatörlerine (TetO2) bağlanan ve Dox/Tet yokluğunda ekspresyonlarını susturan tetrasiklin baskılayıcısını (TetR) eksprese eder. Bu, herhangi bir zamanda LAP etiketli proteinin Dox/Tet ile indüklenebilir ekspresyonuna izin verir. İndüklenebilir LAP etiketli protein ekspresyonu yeteneğine sahip olmak kritik öneme sahiptir, çünkü birçok hücresel yol, yolu yöneten kritik proteinlerin seviyelerine duyarlıdır ve bu proteinler düşük seviyelerde bile yapısal olarak aşırı eksprese edildiğinde hücre büyümesini durdurabilir veya hücre ölümünü tetikleyebilir, bu da indüklenemeyen LAP etiketli kararlı hücre hatlarının oluşumunu imkansız hale getirir12.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Not: ilgi herhangi bir protein için uyanlabilir LAP-etiketli Kararlı hücre çizgileri üretimi genel bir bakış, Şekil 1 'de gösterilen ve LAP-takılı protein ekspresyonu, saflaştırılması ve kütle proteomik hazırlık genel görünüşü Şekil 3'te gösterilmiştir analizleri.

1. LAP-etiketi Vektörü içine İlgi konusu genin açık okuma çerçevesinin (ORF) Klonlama

  1. Mekik vektörüne İlgi geninin ORF klonlanması.
    1. N-terminali füzyon ya da C-terminali füzyon biri için primerler içinde uygun attB1 ve attB2 siteleri ile ilgi dahilindeki ORF öğesini amplifiye etmek için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanarak. PCR, aşağıdaki koşullar astar dizileri ve Tablo 2 Tablo 1'e bakınız.
    2. Jel bir% 1 agaroz jeli üzerinde bunları çözme PCR ürünleri temizler. jelden doğru boyutu güçlendirilmiş bant tüketim ve DNA g kullanılarak jel dilim ayıklamaküreticinin talimatlarına göre el çıkarma kiti.
    3. Mekik vektörü ihtiva eden bir attP ve PCR ürünleri, üreticinin talimatlarına göre vektöre rekombine sağlar rekombinaz PCR ürünlerini ihtiva eden saflaştınlmış attB inkübe (MALZEMELERİNİN Tablo).
      NOT: Boş mekik vektörler ve LAP-etiketleme vektörleri CCD B genini içeren ve CCD B dirençli bakteri hücrelerinde dağıtılmasını gerekir (Malzeme Tablo). Bir ORF bu vektörlere sokulur Ancak ccdB geni klonlanmış ORF olan vektörler yayılan olduğunda bu nedenle standart DH5α E.coli hücreleri kullanmak, üzerinden yeniden oluşturulur.
    4. Luria etsuyu (LB) 50 mg agar / ml kanamisin 13 üzerine dönüştürülmüş hücrelerin reaksiyon ürünü 1 ul DH5α E.coli hücrelerini dönüştürmek ve levha.
    5. Kanamisin dirençli koloniler seçin.
    6. LB beni seçilen koloniler büyütün50 mg / ml kanamisin ile çap, bir DNA mini hazırlık yapmak ve Tablo 3'te listelenen sıralama primerleri kullanılarak DNA dizilemesi ile gen entegrasyonu teyit etmektedir.
  2. LAP-etiketi Vektörü içine mekik vektöründe İlgi konusu genin transferi.
    1. LAP-etiketi vektör ve uygun olarak LAP-etiketi vektörü içine mekik vektöründe ilgi konusu genin transferi aracılık rekombinazın (Füzyon N-terminali için pGLAP1) faiz ORF dizisi doğrulanmış genini içeren mekik vektörü inkübe üreticinin talimatlarına (Malzeme).
      Not: İstenilen promoteri, epitop etiketi göre kullanılabilecek LAP / TAP vektörler bir dizi ve N ya da C-terminali etiketleme Tablo 4'te bulunabilir.
    2. 100 mg / ml ampisilin 13 LB agar plakası üzerine dönüştürülmüş hücrelerin reaksiyon ürünü 1 ul DH5α E.coli hücrelerini dönüştürmek ve levha.
    3. Ampisilin dirençli Colo seçinnies.
    4. Ve 100 mg / ml Ampisilin ile LB ortamında seçilmiştir koloniler büyümeye bir DNA mini hazırlık yapmak ve Tablo 5'te listelenen sıralama primerleri kullanılarak DNA dizilemesi ile gen entegrasyonu teyit etmektedir.

İlgi LAP-etiketli Gene ifade bir indüklenebi- Kararlı Hücre Hattı 2. Nesil

  1. ilgi proje için en uygun hücre satırı seçin. Alternatif olarak, yapısal TetR ifade ve (Malzeme) ilgi LAP-etiketli gen stabil genomuna entegre sağlayan bir FRT bölgesini içeren herhangi bir mevcut hücre hattından bir konak hücre çizgi oluşturmak.
    NOT: Bu protokol, 4 [Tetrasiklin (-Tet) yoksun,% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile yapılan] -Tet DMEM / F12 ortamında yetiştirilir TetR bir FRT bölgesini içeren bir HEK293 hücre çizgisi kullanılır .
  2. Higromisin minimum konsantrasyonu belirlemek 2 çiş 1 içinde konak hücre hattını öldürmek için gerekliilaç ilavesini takip eden KS. konsantrasyonu çok 100 mi ug / 800 ug / ml arasında değişen olan konakçı hücre hatları arasında değişebilir.
    Not: 37 ° C ve% 5 CO2 1-2 hafta içinde ölür 100 ug / ml Higromisin ile -Tet DMEM / F12 ortamında yetiştirildi HEK293 hücreleri.
  3. Eş-transfekte flippase rekombinaz bir transfeksiyon ayıracı kullanılarak HEK293 hücrelerine LAP-etiketli vektörü (hücre genomu içinde bir FRT bölgesini içine ilgi LAP-işaretli genin entegre aracılık) ifade vektörü ve üretici talimatlarına göre . 4 oranını kullanın: rekombinaz vektörü 1 LAP vektörü 14.
    NOT: Optimum oran transfeksiyon konakçı hücre hattı ve yöntemine bağlıdır ve bir titrasyon gerektirir. 4: 1'lik bir oranı çoğu hücre hatları için çalışır. Bir negatif kontrol olarak, bir yalancı-transfekte plaka içerir.
  4. Bir gün post-transfeksiyon, taze ortam ile -Tet DMEM / F12 ortamı değiştirin.
  5. İki gün sonrası transfecti% 25 izdiham, split hücreler üzerinde. hücreler, takmak için 5 saat, o zaman adım 2.2 önceden belirlenmiş bir konsantrasyonda Higromisin içeren -Tet DMEM / F12 ortamı ilave izin verin. HEK293 için hücreler, 100 ug / ml Higromisin kullanımı.
    Not: HEK293 hücre çizgisi ihtiva eden FRT da blasticidin direnç ile ilişkilidir, bu nedenle 5 mg / ml Blasticidin TetR seçmek için ve sızan ifade en aza indirmek için, stabil hücre hattı seçim sürecinde kullanılan TetR içerir.
  6. farklı hücre odakları şeffaf plaka karşı opak noktalar benzediğine görünene kadar gerektiği gibi -Tet DMEM / F12 ortamı Higromisin içeren değiştirin.
  7. 200 ul pipetlemeyin ucu ile her hücre odaklarının üstüne tripsin 20 ul ekleyin ve pipetlemeyin yukarı ve aşağı 2 kez. Talep 24 oyuklu bir plaka içerisinde hücre ve Higromisin içeren -Tet DMEM / F12 ortamı sürekli büyüme hücreleri genişletmek.
  8. Sabit hücre veya canlı hücre floresan mikroskop ile uyarılabilir LAP-etiketli protein ekspresyonu için ekran hücreleri ve / veyaLAP-etiketi 15 içinde GFP etiketi için Western blot.

LAP-etiketli Protein Kompleksleri 3. saflaştırılması

NOT: Bir önceki deneyime dayalı tipik bir LAP-etiketli protein saflaştırılması için kullanılan şartlar ve birimlerde aşağıdaki LAP-etiketli protein saflaştırma protokolü ayrıntıları öneriler. Bununla birlikte, dikkatli ampirik optimizasyon en iyi sonuçlar sağlamak için bir çıkar protein kompleksi ve protein ekspresyon düzeyi için gerçekleştirilir sağlamak için dikkatli olunmalıdır.

  1. Hücre Büyümesi ve Hücre Hasat.
    1. Sürekli, 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde -Tet DMEM / F12 ortamı içinde daha büyük bir paneli ve / veya silindir şişelerde içine tüm HEK293 hücreleri pasajlanarak, protein kompleksleri TAP izolasyonu için geçerli LAP-etiketli hücre hattı genişletmek.
    2. Tet / DOX uyarılabilir hücre çizgileri için, harvestin önce, 0.2 mg / ml Tet / DOX hücrelere ulaşmaya ~% 70 ortak akışkanlığa bir konsantrasyonda 10-15 saat boyunca teşvikg kadar hücre.
      NOT: konsantrasyon ve indüksiyon süresi her protein için tespit edilmelidir, 10-15 saat boyunca 0.1-1 mg / ml Tet / Dox bir titrasyonu tavsiye edilir.
    3. ajitasyon ya da trypsinization ve pelet hücreleri 5-10 dakika boyunca 875 xg'de tarafından Hasat hücreleri.
  2. Kavrama anti-GFP, antikor proteininin bir Beads
    1. Bir 0.5 ml'lik hücre topağından hazırlanabilir lizat, paketlenmiş hücre hacmi (PCV) için immüno-çökeltme için antikorun 40 ug kullanın.
      Not: diğer faktörlerin yanı sıra LAP-etiketli protein bolluğu bağlıdır gereken antikor miktarı ve optimizasyon gerektirir. 10-40 ug bir titrasyonu tavsiye edilir.
    2. 1.5 ml bir tüp içinde PBST (PBS +% 0.1 Tween-20) içine 160 ul paketlenmiş hacmi (PV), Protein A boncuk dengelenmesi. PBST 1 ml ile 3 kez yıkanır.
      Not: Buradaki tüm yıkamalar 10 saniye boyunca 5000 x g'de boncuk santrifüjle gerçekleştirilir.
    3. Süspanse boncuklar 500 ul PBST ve afinite 80 ug ekleyin160 ul boncuk her tüpe -purified tavşan anti-GFP antikoru. Oda sıcaklığında 1 saat (RT) karıştırılır.
    4. PBST 1 ml boncuk 2 kez yıkayın. Daha sonra, 0.2 M sodyum borat, pH 9 (20 ml 0.2 M sodyum-borat-+ 15 ml 0.2 M borik asit) 1 ml boncuk 2 kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, 1 ml nihai hacim getirmek için 0.2 M sodyum borat 900 ul, pH 9 ekleyin.
    5. 20 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar 220 mM dimethylpimelimidate (DMP), 100 ul ekle. 30 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça tüpler döndürün. 220 mM DMP için, 0.2 M sodyum borat, pH 9 877 ul 50mg şişe içeriğini tekrar süspansiyon ve boncuk süspansiyonu hemen ekleyin.
    6. DMP ile inkübe edildikten sonra, bakiye çapraz bağlayıcı inaktive edilmesi için 0.2 M etanolamin, 0.2 M NaCl, pH 8.5, 1 ml boncuklardan 1 kez yıkayın. aynı tampon ile 1 ml içinde süspanse boncuklar, oda sıcaklığında 1 saat boyunca döner. Pelet boncuk ve 0.2 M etanolamin, 0.2 M NaCl, pH 8.5, 500 ul içinde süspanse boncuklar. Boncuk Severa stabildir4 ° C'de l aydır.
  3. Hücre parçalama ve Kompleks Arıtma için Tamponlar hazırlanması
    1. pH 7.4 çözeltisi yaparak (hücre parçalama 300 mm, ve en kordon yıkama için 200 mm ve yıkama boncuk 100 mM elüsyon öncesinde proteinleri X LAP tampon maddesi arzu edilen tuz konsantrasyonu, [mM KCI] IS) LAPX tamponlar hazırlamak 50 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), X mM KCI, 1 mM etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 1 mM MgCl2 ve% 10 gliserol ihtiva etmektedir.
      NOT: Bu tampon bileşenleri canlı hücre ortamı yaklaşık kullanılmaktadır. HEPES 7.2-8.2 pH öfke bir tampon olarak kullanılır. KCI tamponunun iyonik mukavemetini muhafaza etmek için kullanılan bir tuzudur. EGTA magnezyum göre kalsiyum seviyelerini azaltmak için kalsiyum iyonu bağlanan bir kenetleme maddesidir. Gliserol ve MgCl2, proteinlerin stablitesini geliştirmek için kullanılmaktadır.
    2. % 0.05 nonil phenoxypol ekleyerek LAPX K tamponu hazırlayınLAPX tampon yethoxylethanol.
      Not: Nonil phenoxypolyethoxylethanol proteinleri çözünür bir deterjan, ancak bu şekilde daha yüksek bir konsantrasyonu ekstraksiyon işlemi sırasında kullanılan, protein-protein etkileşimleri, koruyan ve daha sonra bağlayıcı ve yıkama adımları sırasında azaltılır.
  4. Hücre lizatlarının Hazırlanması
    1. 0.5 mM ditiyotreitol (DTT) ve proteaz inhibitörleri ile LAP300 2.5 ml PCV 500 ul yeniden süspanse edin. % 10 nonil phenoxypolyethoxylethanol (son% 0.3) 90 ul ekleyin ve ters çevirerek karıştırın.
    2. 10 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. 10 dakika için 21,000 x g'de santrifüjleyin. Bu düşük hız süpernatant (LSS) toplayın. Jel analizi için LSS bir 10 ul örnek almak.
    3. 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca 100,000 x g'de bir TLA100.3 tüp ve spin LSS aktarın. bir boru, bu yüksek hızlı süpernatant (HSS) toplayın ve buz üzerine yerleştirin. Jel analizi için HSS bir 10 ul örnek almak.
      NOT: en üst lipit tabaka almaktan kaçınınd en alttaki hücre enkaz tabakası. lipidlerindeki HSS toplanmadan önce vakum aspirasyon ile çıkarılmalıdır.
  5. İlk Affinity Yakalama: Anti-GFP Boncuk bağlanma
    1. Ön-elute antikoru bağlı boncuklar bağlanmamış kurtulmak için elüsyon tamponu [20 mM Tris, pH 7.4 ile 3.5 M MgCl2] 1 ml olanağına 3 kez yıkanarak (0.5 mi hücre peleti (PCV) her boncuk 160 ul kullanın) antikorlar ve arka plan azaltır. çabuk yapın. uzun süre yüksek tuz boncuk bırakmayın.
    2. LAP200 N, 1 ml boncuk 3 kez yıkayın. HSS 4 ° C 'de 1 saat süre ile, antikor boncuklar ile ekstrakte karıştırın. 10 dakika için 21,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatan 10 ul örneği almak (yani, (FT) üzerinden akış) jel analizi için.
    3. 0.5 mM DTT ve proteaz inhibitörleri ile LAP200 N, 1 ml boncuk 3 kez yıkayın. 0.5 mM DTT ve proteaz inhibitörleri ile LAP200 N, 1 ml boncuk 2 kez (her biri 5 dakika) yıkanır. 2 t çabucak yıkayın1 0.5 mM DTT ile LAP200 ml N, tütün dağlama virüsünün (TEV) proteaz eklemeden önce proteaz inhibitörleri ile katı daha.
  6. TEV Dilinim
    1. LAP200 N, 1 ml 10 ug TEV proteaz ile seyreltilir ve gece boyunca 4 ° C'de tüpler döndürün.
      NOT: Bu adım, LAP-etiketli protein için optimize edilebilir LAP-etiketli protein kompleksleri korunması yardımcı olabilir TEV proteaz konsantrasyonu ayarlanarak birkaç saat içinde tamamlanması.
    2. yeni bir tüp Pelet boncuk ve transfer süpernatant. Herhangi bir artık proteinin ayrılması için 0.5 mM DTT ile 160 ul LAP200 N ve proteaz inhibitörleri (üç konsantrasyon) ile iki kez boncuk durulayın. jel analizi için süpernatan 10 ul numune alın.
  7. İkinci afinite yakalama: S proteini agaroza Bağlama
    1. 80 ul S proteini agaroz bulamacın 1 tüp (40 ul paketlenmiş reçine) LAP200 N, 1 ml ile 3 kez yıkanır.
      NOT: S protEin aktif RNAaz ari tekrar eski halini alır, S-etiketi bağlanabilen ve alternatif bir ikinci epitopu etiketi RNA ihtiva eden protein kompleksleri dikkate alınmalıdır.
    2. Ekle TEV 4 ° C sıcaklıkta 3 saat S proteini agaroz boncuklar ve kaya supernatant yıkandı. Pelet boncuklar ve 0.5 mM DTT ve proteaz inhibitörleri ile LAP200 N, 1 ml ile 3 kez yıkanır. LAP100 1 ml boncuk 2 kez yıkayın.
  8. Protein elüsyonu
    1. 10 dakika boyunca 97 ° C'de 4 x Laemmli numune tampon maddesi ve ısı 50 ul ekleyerek agaroz S proteini proteinler, Zehir.
      Not: Proteinler elüsyon tamponu (20 mM Tris, pH 7.4 ile 3.5 M MgCI2) boncuklardan elüte edilebilir.

4. Kütle Spektrometresi Analizi Proteinler etkileşim tanımlayın

  1. (bakınız, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE), gümüş boyama jel toplandı numunelerinin analiz ile saflaştırma kalitesini test Malzeme Tablosu) ve eluatları immün ve bakınız Şekil 4, LAP-etiketli arıtma 16 çalıştı emin olmak için anti-GFP antikorlar ile sondalama ile.
  2. stokiyometrik ve altstoikiometrik ortak arıtma türlerini tanımlamak için, nihai elüsyon örnek almak ve SDS-PAGE ile ayırın. Bir kütle spektrometresi uyumlu protein boyası ile jel Leke. En önemli bantları ve jelden aralarında boşluk tüketim ve kütle spektrometresi ayrı ayrı 16 ile analiz için onları süreci.
    NOT: son saflaştırma eluatları ayrılması ve kütle spektrometresi 5 için onları hazırlamak için çeşitli yaklaşımlar bulunmaktadır. Örneğin, LAP-arıtılmış, kompleksleri, yüksek tuz (3.5 M MgCI2) ve kitle halinde kütle spektrometrisi 17 ile analiz edilebilir en bütün protein popülasyonu kullanılarak S-proteinini tanelerden elüt edilebilir. Alternatif olarak, nihai sıvı kısımlar 1 SDS-PAGE ile mm ve e değişen tek bir 1mM bandı için ayrılabilirxcised ve analiz edildi. Bu analiz engel olacak bir boncuk veya tanecikli maddenin kompleks bir karışımı temizler.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu sistemin yardımcı vurgulamak için, Tau mikrotübül bağlama proteini açık okuma çerçevesi (ORF) sahip PCR ürünleri attB1 ve attB2 bölgelerini içeren primerler ile Tau ORF'nin büyütülmesi (Tablo 1) ve kuluçkalama ile mekik vektörüne klonlanmıştır mekik vektörü ve mekik vektörüne PCR ürünlerinin sokulmasını aracılık eden bir rekombinaz. Reaksiyon ürünleri Tau takılmasını sağlamak için dizilenmiştir Kanamisin dirençli koloniler DH5α bakteriler 13 ve plazmid DNA dönüştürmek için kullanılmıştır. Dizisi doğrulanmış mekik Tau vektör daha sonra, pGLAP1 vektörü ile mekik Tau vektör inkübe edilerek LAP (EGFP-TEV-S-protein) etiketi ile çerçeve içinde Tau kaynaşık pGLAP1 vektörü içine Tau ORF aktarmak için kullanılan ve pGLAP1 servis vektöründen ORF transferine aracılık rekombinaz. Reaksiyon ürünleri DH5α bakterilerini transforme etmek için kullanılmıştırAmpisilin dirençli koloniler 13 ve plazmid DNA LAP-tau füzyon çerçeve içinde olmasını sağlamak için dizilenmiştir. Sıra pGLAP1-LAP-Tau sonra tek flippase tanıma hedef LAP-etiketli genler için entegrasyon sitedir kendi genomu içinde (FRT) sitesi, içerdiği HEK293 hücrelerine flippase rekombinasyon enzimi ifade eden bir vektör ile transfekte eş oldu valide 14. Bu hücre hattı ayrıca LAP-işaretli genlerin yukan tet operatörü bağlanır ve Tet / Dox yokluğunda kendi ekspresyonunu susturduğu TetR ifade edilmiştir. Kararlı bütünleyicilerin 5 gün boyunca 100 ug / ml Higromisin ile -Tet DMEM / F12 ortamı ile seçildi. Bağımsız Higromisin dirençli hücre odakları üzerine tripsin 20 ul ilave edilmesi ve aşağı 2 kere pipetleme ile toplandı. Hücreler, 24 gözlü bir plaka içerisine yerleştirildi ve -Tet DMEM / F12 ortamı sürekli büyüme genişletilmiştir.

Higromisin dirençli hücre doğrulamak içins LAP-Tau ifade edebilen edildi, HEK293 LAP-tau hücreler 15 saat ve protein ekstreleri için 0.1 ug / ml Dox ile indüklenmiştir kaynaklı-olmayan ve Dox kaynaklı hücrelerinden hazırlandı. Bu ekstreler bir PVDF membrana aktarıldı, SDS-PAGE ile ayrılmış ve yükleme kontrolü olarak GFP ve tubulin imünoblotlanır. Şekil 4A, LAP-Tau görüldüğü gibi (anti-GFP antikorları ile görselleştirilmiştir) Sadece Dox mevcudiyetinde ifade edildi. Daha önce endogen tau'nun 18 gösterilmiş olduğu gibi LAP-tau düzgün mitoz sırasında mitotik mikrotübül mili ile sınırlı olduğu doğrulamak için, HEK293 LAP-tau hücreleri 15 saat için 0.1 | ig / ml Dox ile indüklenmiştir ve hücreler,% 4 ile sabitlendi paraformaldehit ve birlikte lekeli DNA (Hoechst 33342) ve bunun mikrotübüller (anti-tubulin antikor) dir. Tutarlı, LAP-Tau mitoz metafaz (Şekil 4B) sırasında mitotik iğ lokalize edilmiştir. LAP-Tau ve etkileşim proteinler doğrulamak için bu sys ile saflaştırılmış olabilirTEM, HEK293 LAP-tau hücreleri, çalkalama ile toplandı, 15 saat süre ile 0.1 ug / ml Dox ile indüklenen, silindir şişeler için ~% 70 konfluansa büyütüldü LAP300 tamponuyla lize ve tur-tau yukarıdaki protokol kullanılarak arıtıldı. LAP-tau saflaştırmadan elde edilen yıkama sıvıları, SDS-PAGE ile yeniden çözülmüş ve jel gümüş lekeli. Şekil 4C Yıldız ile işaretli LAP-Tau arıtma, LAP-Tau ve Tau etkileşen proteinlerin göstergesidir görülebilir birçok bantları olduğunu gösterir.

figure-results-1
Şekil 1: İlgi herhangi Protein LAP-etiketli indüklenebi- Kararlı Hücre Hatlarının Kuşağı bakış. ilgi genlerinin açık okuma çerçevesi (ORF) attB1 ve attB2 siteleri sırasıyla 5 've 3' ucu dizilerinin, eteklenen ile amplifiye edilir (primer dizileri verilmektedir Tablo 1) ve klonlanmıştır mekik vektörü. söz konusu gen ile dizi belirlenmiş mekik vektörleri daha sonra pGLAP1 vektörüne ilgi gen transferi için kullanılır. ilgili gen ile pGLAP1 vektörü belirlenmiş dizisi daha sonra tek bir flippase tanıma hedef tur için entegrasyon edilir genomları içinde (STT) mevkisini ihtiva istenen hücre hattı flippase rekombinazı ihtiva eden bir vektör ile birlikte transfekte olan etiketli genler. Bu hücre hatları da LAP-etiketli genlerin yukarı Tet bastırıcı Tet operatörleri bağlanan (TetR) (TETO 2) ifade ve Tet / Dox yokluğunda onların ifadesini susturur. ilgi LAP-etiketli gen daha sonra FRT sitesine recombined ve istikrarlı integrants Higromisin ile seçilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2 "src =" / files / ftp_upload / 54870 / 54870fig2.jpg "/>
Şekil 2: LAP-etiketli Kararlı Hücre Hatları için Uygulamalarına Genel Bakış. LAP-etiketli uyarılabilir stabil hücre hatları Dox ilavesiyle ilgi LAP-etiketli protein eksprese etmek için uyarılan ve hücre döngüsünün çeşitli evrelerinde senkronize edilebilir veya arzu edilen herhangi bir sinyalleme yolunun aktive edilmesi ya da kimyasal ligandlar ile uyarılabilir. ilgi LAP-etiketli proteinin hücre içi lokalizasyonu canlı hücre ya da sabit bir hücre görüntüleme ile analiz edilebilir. LAP-etiketli proteinler, ikili afinite saflaştırılmış ve etkileşim proteinleri sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS / MS) ile tespit edilebilir olabilir. Son olarak, Cytoscape yem protein, bir protein-protein etkileşimi ağı oluşturmak için de kullanılabilir. Dox TEV TEV proteaz bölünme sitesini gösterir EGFP yeşil flüoresan protein gelişmiş gösterir, IP immünopresipitasyon gösterir, doksisiklin gösterir ve S S-etiketini gösterir.http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54870/54870fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 3: Kütle Spektrometre için LAP-etiketli Protein Ekspresyonu, Saflaştırılması ve Hazırlanması Genel Bakış. LAP-etiketli protein ekspresyonu 1) büyüme ve indüksiyonu lizatlarının, 2) hücre hasat ve parçalama, 3) hazırlanması, 4), anti-GFP tanelere lizatları bağlanması, 5) TEV proteaz bölünme: 9 protokolü basamaklıdır GFP-eklentisi, 6), S-proteini tanelere lizatları bağlanması, 7) yem protein ve etkileşen proteinleri ve 8-9) kütle spektrometrisi bazlı proteomik analiz için numune hazırlanması elüsyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 4: LAP-Tau ifade doğrulanması. (A), Western Blot (WB), sırasıyla, LAP-etiketli Tau protein ve tubulin yükleme kontrolü tespit etmek için bir anti-GFP ve anti-tubulin antikor ile problanmıştır neden kaynaklı-olmayan ve Dox LAP-tau HEK293 hücrelerinden protein örneklerinin analizi. Hücreler Dox ile uyarılan zaman LAP-Tau sadece ifade edilir unutmayın. LAP-tau'nun (B) Mitotik hücreler sabitlendi ve birlikte lekeli anti-tubulin antikor ve LAP-tau hücre içi lokalizasyonu ile DNA (Hoechst 33342) ve tubulin (döşeme) için floresan microcopy ile analiz edilmiştir. LAP-Tau mitoz sırasında mitotik iğ ve iğ kutuplara lokalize edin. (C), gümüş LAP-tau arıtma jel boyandı. MA, molekül ağırlığı gösterir CL temizlenir lizatları ve E Hint gösterirates nihai sıvı kısımlar. Örnekler 4-20% SDS-PAGE üzerinde yapılır ve jel gümüş saflaştırılmış proteinler görselleştirmek için boyandı. LAP-Tau karşılık gelen bir grup bir yıldızla ve görülebilir proteinlerin-saflaştırılması eş karşılık gelen diğer bazı gruplarla işaretli olduğunu unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
N-terminali füzyon
ileri 5'-GGGGACAAGT TTGTACAAAAAAGCAGGCT TCATG - (> 18gsn) -3 '
Ters 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT T TTATCA - (> 18gsn) -3 '
C-terminali füzyonu
ileri 5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT TCACC - (> 18gsn) -3 '
Ters 5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT G (-> 18gsn) -3 '

Tablo 1: İleri ve Servis vektörü içine sokulmak için ORF veya Faiz Genişletici için Astarlar Ters. attB siteleri koyu harflerle vurgulanır, GSN 18'den fazla gen spesifik nükleotid primer eklenir olduğunu gösterir.

Adım Sıcaklık Zaman
ilk denatürasyon 94 ° C 2 dakika
PCR amplifikasyon döngüsü (35) doğasını değiştirmek 94 ° C 30 sn
tavlamak 55 ° C (primer Tm bağlı olarak) 30 sn
uzatmak 72 ° C 1 dak / kb
Ambar 4 ° C süresiz olarak

Tablo 2: İlgi ORF'lerin yükseltilmesi için PCR Koşulları.

Vektör İleri Sıralama Astar Ardışık ters primer
mekik vektörüne 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ' 5'-CAGGAAACAGCTATGAC-3 '

Tablo 3: Servis Vektör için İleri ve Geri Sıralama astarlar.

İD yapı Ebeveyn destekçi Bac Res Mam Res Tet reg?
pGLAP1 N dönem EGFP-TEV-S peptit pcDNA5 / FRT / TO CMV amper Hyg Evet
pGLAP2 N dönem Flag-TEV-S peptit pcDNA5 / FRT / TO CMV amper Hyg Evet
pGLAP3 N dönem EGFP-TEV-S peptit; C vadeli V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a amper Hyg Yok hayır
pGLAP4 N dönem Flag-TEV-S peptit; ; C vadeli V5 pEF5 / FRT-V5 EF1a Hyg Yok hayır
pGLAP5 C-terminal S peptit PreProt X2-EGFP pEF5 / FRT-V5 EF1a amper Hyg Yok hayır

Tablo 4: Değişken Organizatör, Epitop etiketleri ve N Dox İndüklenebilir İfade Yetenekleri veya C-terminal protein Etiketleme ile kullanılabilir LAP / TAP Vektörlerinin listesi. Vektörler ticari olarak temin edilebilir. Bac Res bakteriyel direnç işaretçisi gösterir, anne Res memeli hücre direnç işareti, Tet reg göstermektedir? sentezleme Tet / DOX düzenlenebilir olup olmadığını gösterir.

Vektör İleri Sıralama Astar Ardışık ters primer
pGLAP1 5'-ATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP2 5'-CGAACGCCAGCACATGGACAGGG-3 ' 5'-TGGCTGGCAACTAGAAGGCACAGTCGAGGC-3 '
pGLAP3 5'-AGAAACCGCTGCTGCTAA-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP4 5'-AGACCCAAGCTGGCTAGGTAAGC-3 ' 5'-TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 '
pGLAP5 5'-CGTAATACGACTCACTATAG-3 ' 5'-TCCAGGGTCAAGGAAGGCACGG-3 '

Tablo 5: pGLAP Vektörler için İleri ve Geri Sıralama astarlar.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ana hatları çizilen protokol LAP etiketleme vektörüne ilgi genlerinin klonlanmasını anlatmaktadır, uyanlabilir LAP-etiketli stabil hücre çizgilerinin üretimi ve proteomik analizler için LAP-etiketli protein komplekslerinin saflaştırılması. diğer LAP / TAP etiketleme yaklaşımları ile ilgili olarak, bu protokol herhangi bir hücresel yolunun içinde protein lokalizasyonu ve protein-protein etkileşimleri haritaya yüksek verimli yaklaşımları ile uyumlu olacak şekilde aerodinamik edilmiştir. Bu yaklaşım, geniş bir kaç isim hücre döngüsü ilerlemesinin, mitotik iğ düzeneğinin, mil direği homeostaz ve ciliogenesis kritik proteinlerinin fonksiyonel karakterizasyonu uygulanmış ve bu proteinlerin düzen bozukluğu insan hastalıkları 15 yol ne anlama yardımcı olmuştur 16,19,20. Örneğin, bizim grup son zamanlarda mili montaj 15,21 yılında STARD9 mitotik kinesin fonksiyonu ve düzenleme (bir aday kanser hedef) tanımlamak için bu sistemi kullanılan bir tanımlamaTctex1d2 dynein hafif zincir arasında yeni bir moleküler bağ ve kısa kaburga polidaktili sendromları (stres durumları) 19 ve MID2 ubikitin ligaz mutasyon X'e bağlı zihinsel engelli 16 yol açabilir nasıl anlamak için yeni bir moleküler bağlantı tanımlamak için kullanılır. Diğer laboratuvarlar de başarıyla Tctn1, fare Kirpi sinyal regülatörü, bir ciliopathy-ilişkili protein kompleksinin bir parçası olduğu belirlendi dahil olmak üzere, bu yöntemi uyguladık doku bağımlı bir şekilde 22,23 yılında düzenlenmiş siliyer membran bileşimi ve ciliogenesis. Bu nedenle, bu protokol genel olarak herhangi bir hücresel yolunun diseksiyon uygulanabilir.

Bu protokolde kritik bir safha, Higromisin dirençli LAP-etiketli stabil hücre hatlarının seçimi. Özel dikkat kontrol plakasında tüm hücreler amplifikasyonu için deney plakasında odak seçmeden önce ölü sağlamak için dikkatli olunmalıdır. Higromisin da adde edilebilirLAP-etiketli kararlı hücre hatlarının rutin hücre kültür sırasında d ayrıca tüm hücreleri FRT yerinde ilgi LAP-etiketli geni korumak sağlamak. Sizlere tüm LAP-etiketli proteinler fonksiyonel ve protein fonksiyonunu test etmek için kullanılabilir yerinde deneyleri olması önemli olduğunu dikkatli olun. Protein işlevi test etmek için kullanılan deneyler arasında örnek olarak siRNA bağlı fenotip ve in vitro aktivite deneyini kurtarma içerir. Büyük bir LAP-etiketi eklenmesi ile olası sorunları çözmek için, daha önce ilgilenilen proteinin fonksiyonunu ve lokalizasyonu inhibe az olasıdır FLAG gibi küçük etiketler, ihtiva bu sistemle uyumlu TAP-etiket vektörleri yarattı 4. İlave olarak, sancı etiketleme vektörler C-terminali LAP-etiketli proteinler veya bir bindirme / TAP etiketi N tolere edilmediği durumlarda kullanılabilir, bu sistemde, ile uyumlu olan C-terminali TAP-etiketli proteinleri üretmek için ana kadar bir proteinin -terminus. Buna ek olarak, incisaflaştırma tamponlar (LAPX N) e tuzu ve deterjan konsantrasyonu artırmak veya yok ya da çok etkileşimi görülmesi halinde saflaştırma sıkılığına azaltmak için değiştirilebilir. Benzer şekilde, tandem yakınlık arıtma işlemi az veya hiç interaktörler tespit edildiğinde bu nedenle tek bir arıtma şeması kullanılabilir, kaybolmuş olabilir saflaştırma prosedürleri ve zayıf interaktörler tek daha sıkı olduğunu.

Diğer GFP epitop etiketleme yaklaşımları protein yerelleştirme ve arıtma çalışmaları 24,25 için etiketleme büyük ölçekli GFP proteini izin vermesini var olduğunu not etmek önemlidir. Bu düzenleme elemanlarını, taklit endojen gen ifadesi 24 içeren kendi doğal ortamından ilgi GFP etiketli genleri ifade etmek için bakteriyel suni kromozom kullanan BAC TransgenOmics yolla uygulanabilir. Daha yakın zamanda, CAS9 / tek destekli RNA (sgRNA) ribonükleoprotein kompleksler (RNP) son kullanılmışogenously endojen genomik lokusları 25 GFP-etiketli gen ekspresyonunu sağlayan bir iki-GFP sistemi ile ilgili genleri etiketleyin. Bu yaklaşımların de burada tarif edilen LAP etiketleme protokolüne göre, endojen koşullar altında etiketli proteinlerin ekspresyonunu sağlayacak olmakla birlikte, ilgi işaretli genlerin indüklenebilir ve ayarlanabilir ifadesi için izin yoktur. Ek olarak, TAP için etiketleme ikili epitopa uygulanacak henüz. Diğer etiketleme sistemleri aynı zamanda, uyarılabilir epitop etiketli kararlı hücre kuşaklarının üretilmesi için burada açıklanan sistem ile uyumlu olmak için modifiye edilebileceğini not etmek önemlidir. Örneğin, yakınlık bağımlı biyotin tanımlama (BioID) nedeniyle etkileşim proteinler 26 arasında mekansal ve zamansal ilişkileri tanımlamak için onun yeteneği büyük ilgi topladı. Bu teknik, Escherichia coli biyotin ligaz bira bir rasgele soyu, biotinylate protein füzyonları yararlananenzimin ~ 10 nm yarıçapı içinde herhangi bir protein s. Biyotinile proteinler daha sonra afinite biyotin-afinite yakalama kullanarak saflaştınldı ve kütle spektrometrisi ile bileşim için analiz edilmiştir. BirA kompleks 27 olan zayıf etkileşim ortakları tespit edilmesi için özellikle uygun hale getirir ki, daha geçici, yakın herhangi bir protein biotinylate olacaktır. Buna ek olarak, saflaştırma şeması endojen protein-protein etkileşimleri sağlam kalır ve böylece yanlış pozitif oranını azaltır, denatüre edici koşullar altında gerçekleştirilebilir ki gerektirmez. Mevcut protokol kapsamında, bir BirA etiketleme vektör tarafından pGLAP1 vektörünün ikame yakınlık dayalı bunları tespit etmek afinite dayalı protein-protein etkileşimleri tanımlayan bu sistem dönüştürebilir. Birçok enzim-substrat etkileşimleri arasında uzaysal protein-protein inte eşleştirmek için olduğu gibi bu tür bir sistem, geçici protein etkileşimlerini tespit etmek için oldukça avantajlı olacaktırsentrozom ve kirpikler 26,28 için gerçekleştirilmiştir olarak tanımlanan yapılar içinde kasılma konsantrasyona.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibesi NSF-MCB1243645 (JZT) tarafından desteklenmiştir, bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya tavsiye yazarlara aittir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmayabilir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Flp-In T-REx Çekirdek KitiFRT bölgesi ve TrtR ekspresyonu içeren hücre hatları oluşturmak içinInvitrogenK6500-01
PETG, 5xNunc, Inc. 73520-734Büyüyen hücreler için rulo şişe
PETG, 2.5xNunc, Inc. 73520-420Büyüyen hücreler için rulo şişe
Hücre istifleyicilerCorning CellSTACK3271Büyüyen hücreler için hücre istifleyici
500 ml konik santrifüj tüpleriCorning 431123Hücreleri toplamak için tüpler
Anti-GFP antikoruInvitrogenA11122Tavşan anti GFP antikoru
Affiprep Protein A boncuklarıBiorad156-0006Anti-GFP antikorlarını konjuge etmek için bir matris olarak kullanılır
Dimetilpimelimidat (DMP)ThermoFisher Scientific21667Anti-GFP antikorlarını Protein A boncuklarına konjuge etmek için kullanılır
TLA100.3 tüpleriBeckman349622Temizleme adımı sırasında protein lizatlarını santrifüjlemek için
TEV proteazInvitrogen12575-015N-terminal LAP etiketli proteinlerin GFP etiketini ayırmak için kullanılır
Presesyon ProteazGE Healthcare27-0843-01C-terminal LAP etiketli proteinlerin GFP etiketini ayırmak için kullanılır
S-protein agarozNovagen69704LAP etiketli protein komplekslerinin saflaştırılması sırasında ikinci bir afinite matrisi olarak kullanılır
QIAquick DNA jel ekstraksiyon kitiQiagen28704/28706Bir agaroz jelden PCR ürünlerinin saflaştırılmasında kullanım için
BP klonaz IIInvitrogen11789020ORF PCR ürünlerini pDONR221 mekik vektörü
LR klonaz IIInvitrogen11791020klonlamak için kullanılırİlgilenilen genin ORF'sini pGLAP1 LAP etiketleme vektörüne klonlamak için kullanılır
ccdB Survival 2 T1R E. coliInvitrogenA10460Mekik vektörlerini ve pGLAP boş vektörlerini yaymak için kullanılır
Fugene 6PromegaE2691Vektörleri insan hücrelerine dönüştürmek için transfeksiyon reaktifi
TetrasiklinInvitrogenQ100-19Dox / Tet ile indüklenebilir protein ekspresyonunu indüklemek için ilaç 
Dox / Tet ile indüklenebilir protein ekspresyonunu indüklemek içinDoksisiklinClontech631311
Higromisin BInvitrogen10687010Kararlı LAP etiketli integrantları seçmek için ilaç
KanamisinCorning61-176-RGKanamisine dirençli bakteri kolonilerini seçmek için ilaç
AmpisilinFisherBP1760-5Ampisiline dirençli bakteri kolonilerini seçmek için ilaç
% 4-20 Tris Glisin SDS-PAGE jelleriBiorad4561094Protein numunelerini ve son LAP-tag saflaştırma elüatlarını ayırmak için kullanılır
Silver Stain Plus KitBiorad1610449Saflaştırma işlemi boyunca toplanan LAP etiketli pufikasyonların ve numunelerin eluatlarını gümüş boyamak için kullanılır 
Coomassie Blue stainInvitrogenLC6060LAP etiketli saflaştırmaları görselleştirmek ve protein bantlarını kesmek için SDS-PAGE jellerini boyamak için kullanılır, kütle spektrometresi uyumlu
Mekik vektörü pDONR221Invitrogen12536017İlgilenilen genlerin ORF'lerini klonlamak için mekik vektörü
Flippase ifade eden vektör pOG44InvitrogenV600520LAP etiketli genleri, hücre dizileri içeren FRT bölgesinin genomuna entegre etmek için Flippase rekombinazını ifade eden vektör
Platin Taq DNA PolimerazThermoFisher Scientific10966018İlgilenilen genlerin ORF'lerinin PCR amplifikasyonu için kullanılır
4x Laemmli numune tamponuBiorad1610747Boncuk matrisinden saflaştırılmış LAP etiketli protein komplekslerini ayrıştırmak için numune tamponu
Luria suyu (LB) ortamıFisherBP9723-2DH5 ve alfa yetiştirmek için kullanılır; bakteri
DNA mini hazırlık kitiPromegaA1222DNA plazmid mini hazırlıkları yapmak için kullanılır
DMEM/F12 ortamıHycloneSH30023.01Hek293 insan hücrelerini büyütmek için
TetAltanta BiologicalsS10350indüklenebilir LAP etiketli kararlı hücre hatları oluşturmak ve büyütmek için -Tet DMEM/F12 ortamı yapmak için kullanılır
Tripsin HiponSH30042.01Hek293 hücre odaklarını plakalardan kaldırmak için
Proteaz inhibitör tabletleriRoche11836170001Protokol tamponları yapmak için kullanılır, EDTA içermez%
10 nonil fenoksipolietoksiletanol ve nbsp;Roche11332473001Protokol tamponları yapmak için kullanılır
PBSCorning21-040-CMProtokol tamponları yapmak için kullanılır
Tween-20FisherBP337-500Protokol tamponları yapmak için kullanılır
Sodyum BoratFisherS249-500Protokol tamponları yapmak için kullanılır
Borik AsitFisherA78-500Protokol tamponları yapmak için kullanılır
EtanolaminCalbiochem34115Protokol tamponları yapmak için kullanılır
NaClFisherP217-3Protokol tamponları yapmak için kullanılır
KClFisherBP358-10Protokol tamponları yapmak için kullanılır
Dithiothreitol (DTT)FisherBP172-25Protokol tamponları yapmak için kullanılır
MgCl2FisherM33-500Protokol tamponları yapmak için kullanılır
Tris baseFisherBP152-5Protokol tamponları yapmak için kullanılır
Bir Kiti tüpler İlaç  Altanta Biologicals S10350 Tet

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).">Rigaut, G., et al. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).
  2. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).">Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification. Methods. 24, 218-229 (2001).
  3. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).">Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci STKE. , (2005).
  4. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).">Torres, J. Z., Miller, J. J., Jackson, P. K. High-throughput generation of tagged stable cell lines for proteomic analysis. Proteomics. 9, 2888-2891 (2009).
  5. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).">LaCava, J., et al. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: pointers, pitfalls, preferences and perspectives. Biotechniques. 58, 103-119 (2015).
  6. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).">Landy, A. Dynamic, structural, and regulatory aspects of lambda site-specific recombination. Annu Rev Biochem. 58, 913-949 (1989).
  7. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).">Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Res. 10, 1788-1795 (2000).
  8. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).">ORFeome Collaboration. The ORFeome Collaboration: a genome-scale human ORF-clone resource. Nat Methods. 13, 191-192 (2016).
  9. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).">Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. ORFeome cloning and systems biology: standardized mass production of the parts from the parts-list. Genome Res. 14, 2001-2009 (2004).
  10. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).">Lamesch, P., et al. hORFeome v3.1: a resource of human open reading frames representing over 10,000 human genes. Genomics. 89, 307-315 (2007).
  11. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).">Rual, J. F., et al. Human ORFeome version 1.1: a platform for reverse proteomics. Genome Res. 14, 2128-2135 (2004).
  12. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).">Fiering, S., Kim, C. G., Epner, E. M., Groudine, M. An "in-out" strategy using gene targeting and FLP recombinase for the functional dissection of complex DNA regulatory elements: analysis of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8469-8473 (1993).
  13. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).">Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning : a laboratory manual. , 2nd, Cold Spring Harbor Laboratory. (1989).
  14. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).">Uyttersprot, N., Costagliola, S., Miot, F. A new tool for efficient transfection of dog and human thyrocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol. 142, 35-39 (1998).
  15. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).">Senese, S., et al. A unique insertion in STARD9's motor domain regulates its stability. Mol Biol Cell. 26, 440-452 (2015).
  16. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).">Gholkar, A. A., et al. The X-Linked-Intellectual-Disability-Associated Ubiquitin Ligase Mid2 Interacts with Astrin and Regulates Astrin Levels to Promote Cell Division. Cell Rep. 14, 180-188 (2016).
  17. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).">Graumann, J., et al. Applicability of tandem affinity purification MudPIT to pathway proteomics in yeast. Mol Cell Proteomics. 3, 226-237 (2004).
  18. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).">Connolly, J. A., Kalnins, V. I., Cleveland, D. W., Kirschner, M. W. Immunoflourescent staining of cytoplasmic and spindle microtubules in mouse fibroblasts with antibody to tau protein. Proc Natl Acad Sci U S A. 74, 2437-2440 (1977).
  19. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).">Gholkar, A. A., et al. Tctex1d2 associates with short-rib polydactyly syndrome proteins and is required for ciliogenesis. Cell Cycle. 14, 1116-1125 (2015).
  20. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).">Cheung, K., et al. Proteomic Analysis of the Mammalian Katanin Family of Microtubule-severing Enzymes Defines Katanin p80 subunit B-like 1 (KATNBL1) as a Regulator of Mammalian Katanin Microtubule-severing. Mol Cell Proteomics. 15, 1658-1669 (2016).
  21. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).">Torres, J. Z., et al. The STARD9/Kif16a Kinesin Associates with Mitotic Microtubules and Regulates Spindle Pole Assembly. Cell. 147, 1309-1323 (2011).
  22. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).">Garcia-Gonzalo, F. R., et al. A transition zone complex regulates mammalian ciliogenesis and ciliary membrane composition. Nat Genet. 43, 776-784 (2011).
  23. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).">Chih, B., et al. A ciliopathy complex at the transition zone protects the cilia as a privileged membrane domain. Nat Cell Biol. 14, 61-72 (2012).
  24. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).">Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, E3501-E3508 (2016).
  25. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).">Poser, I., et al. BAC TransgeneOmics: a high-throughput method for exploration of protein function in mammals. Nat Methods. 5, 409-415 (2008).
  26. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).">Firat-Karalar, E. N., Stearns, T. Probing mammalian centrosome structure using BioID proximity-dependent biotinylation. Methods Cell Biol. 129, 153-170 (2015).
  27. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).">Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B. BioID: a screen for protein-protein interactions. Curr Protoc Protein Sci. 74, (2013).
  28. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).">Gupta, G. D., et al. A Dynamic Protein Interaction Landscape of the Human Centrosome-Cilium Interface. Cell. 163, 1484-1499 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

LAP tagged Stable Cell LinesProtein Interaction NetworksSpatiotemporal LocalizationTandem Affinity PurificationInducible Cell LinesHEK293 CellsProtein PurificationFluorescence MicroscopySDS PAGE AnalysisMass Spectrometry

Related Articles