Tissue biomechanics is important for maintaining cell shape and function and for determining phenotype. This report demonstrates non-destructive mechanical protocols for characterizing elastic and viscoelastic properties of human soft tissues, which can be directly applied to tissue-engineered substrates to allow a close matching of engineered materials to native tissue.
Regenerativ medicin syftar till att konstruera material för att ersätta eller återställa skadade eller sjuka organ. De mekaniska egenskaperna hos sådana material bör efterliknar mänskliga vävnader de syftar till att ersätta, att tillhandahålla den nödvändiga anatomiska formen måste materialen kunna upprätthålla de mekaniska krafter de kommer att uppleva när de implanteras i det defekta stället. Även de mekaniska egenskaperna hos vävnadstekniska byggnadsställningar är av stor betydelse, många mänskliga vävnader som genomgår restaurering med Engineered material har inte helt biomekaniskt karakteriserats. Flera tryck- och drag protokoll rapporteras för att utvärdera material, men med stor variation det är svårt att jämföra resultaten mellan studierna. Ytterligare komplicerar studierna är ofta destruktiva natur mekanisk provning. Medan en förståelse för vävnads misslyckande är viktigt, är det också viktigt att ha kunskap om de elastiska och viskoelastiska egenskaper under mer Physiological belastningsförhållanden.
Denna rapport syftar till att ge en minimalt destruktiv protokoll för att utvärdera de tryck- och dragegenskaper mänskliga mjuka vävnader. Som exempel på denna teknik, är dragtestning av huden och den kompressiva testning av brosk beskrivs. Dessa protokoll kan också appliceras direkt på syntetiska material för att säkerställa att de mekaniska egenskaperna är likartade med den nativa vävnaden. Protokoll för att bedöma de mekaniska egenskaperna hos human naturlig vävnad kommer att tillåta en riktmärke för att skapa lämpliga vävnads engineered substitut.
Patienter allt väntar på olika organtransplantationer att behandla misslyckas eller skadade organ. Men med bristen på lämpliga donerade organ är regenerativ medicin syftar till att skapa alternativa lösningar för patienter med gravt organsvikt. Regenerativ medicin syftar till att möta denna kliniska behov av konstruktionsmaterial för att fungera som vävnadsersättning, inklusive mjuka vävnader, såsom brosk och hud. För att skapa ett framgångsrikt material för att återställa skadade vävnader, bör ersättningsmaterial härma egenskaperna hos den naturliga vävnaden det kommer att ersätta 1-2. Gång implanteras kirurgiskt, kommer materialet att behöva tillhandahålla anatomisk form till vävnadsdefekten och således är de mekaniska egenskaperna hos materialet är avgörande 1. Till exempel bör ett material som ersätter öron brosk har lämpliga mekaniska egenskaper för att förhindra kompression av den överliggande huden 2. På samma sätt, ett material ersätta nasal biltilage måste ha lämpliga mekaniska egenskaper för att förhindra kollaps under andning 3. Trots betydelsen av mekaniska egenskaper vid tillverkning material för implantation, har få bevis fokuserat på att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos olika humana vävnader.
Mekaniska kontrollserier kan användas för att fastställa den sammanpressande, draghållfasthet, böjning, eller skjuvegenskaper hos en vävnad. Huden är en mycket anisotrop, viskoelastiska och nästan inkompressibelt material 4-9. Vanligen utskuren hud testas med användning av enaxliga drag metoder, om en lämpligt formad remsa av huden greppas i båda ändarna och sträckta medan lasten och förlängningen registreras 4-9.
Eftersom den huvudsakliga komponenten i alla mjuka vävnader är porvatten, är den mekaniska svaret av brosk starkt relaterad till fluidflödet genom vävnaden 10-11. Mjuka vävnader såsom brosk have traditionellt testade med användning av kompressionstestning. Metoderna för att testa i kompression är ganska varierande, med begränsad, unconfined och indrag är den vanligaste (Figur 1). Inom begränsad komprimering, är en brosk placerades provet i ett ogenomträngligt, vätskefylld väl och laddades genom en porös platta. Eftersom brunnen är icke-porös, flödes fastän brosket är i den vertikala riktningen 12-13. I friliggande patron kompression matas brosk laddas med användning av en icke-porös platta på en icke-porös kammaren, vilket tvingar vätskeflödet att vara övervägande radiell 12-13. Indrag är den mest använda metoden för att utvärdera de biomekaniska egenskaperna hos brosk 12-13. Den består av en indenter, mindre än ytan av provet som testas, är som fällde på provet. Inbuktning har många fördelar jämfört med andra metoder för kompression, inklusive det faktum att inbuktningen kan utföras in situ, enabling testet vara mer fysiologisk (Figur 1) 12-13.
För att förstå de tryck- och dragegenskaperna hos en vävnad, är Youngs elasticitetsmodul typiskt beräknas genom att analysera den linjära delen av spännings-töjningskurvan, vilket indikerar det elastiska motståndet mot kompression eller spänning, oberoende av provstavens storlek 12. Både drag- och tryckkontrollserier kan variera i enlighet med lasten eller deformation anbringas och graden av båda dessa parametrar. För närvarande finns det många olika testprotokoll för att bedöma vävnads mekanik, vilket gör det extremt svårt att tolka eller jämföra resultat från olika studier 6-13. Dessutom har många mekaniska metoder som för närvarande fokuserar på att karakterisera de mekaniska egenskaperna hos vävnaden genom att testa provet för att förstörelse. Vi strävar efter att visa en fördjupning och dragprotokoll som ger direkt, icke-förstörande jämförelse av humantmjuka vävnader och vävnadstekniska konstruktioner.
Vi visar en metod som begränsar de mekaniska testerna för stress men ändå erhåller en Young-elasticitetsmodul i kompression och spänning. Provet betonas antingen spänning eller kompression till ett visst värde, och när det valda spänningsvärde har uppnåtts, är provet får slappna av medan alla data registreras. Denna metod fångar både viskoelastiska och avkoppling egenskaperna hos vävnaden inom samma test, som kan appliceras direkt på syntetmaterial. Vi har använt indraget protokollet att utvärdera mänskliga mjuka vävnader, inklusive hud och brosk 14-16. Brosk bedöms med hjälp av indrag testa och hud utvärderas med hjälp av spänning testa 14-16. Forskare som syftar till att konstruera material med liknande egenskaper som mänskliga mjuka vävnader kan överväga att genomföra dessa protokoll.
Flera drag- och indrag protokoll har publicerats för att karakterisera mänskliga mjuka vävnader. Vi har gett en annan metod, som syftar till att vara mer diagnostik och icke-förstörande. Proverna genomgår mekanisk provning i detta protokoll begränsas av lasten snarare än genom förskjutning, som givare är mer känsliga för att ladda än förskjutning. Därför kan reproduktioner av försöket vara mer exakt över vävnader och syntetiska material. Med användning av denna teknik har vi visat en drag protokoll för utvärdering av hudvävnad och en inbuktning protokoll för analys av broskvävnad. Båda protokollen är snabbt och enkelt att implementera och kan övervägas för karakterisering av mänskliga mjuka vävnader och vävnadstekniska konstruktioner.
En av de viktiga steg i metoden för att erhålla en spännings-avlastningskurva lämplig för analysen är att säkerställa att provet inte glider under testning. Adekvat fixering är required, men detta måste vägas mot att orsaka någon stress på proverna och se till att indenter är vinkelrätt mot ytan för att förhindra varje skjuvbelastning. Det är kritiskt att kompositionen såväl som storleken och formen av vävnaden är liknande mellan proven. För brosk, är det viktigt att använda en repeterbar dissektion protokoll och provdimensioner. För hudprover, är det viktigt att avlägsna all den subkutana vävnaden för att erhålla en repeterbar prov. Det är också viktigt att se till att för alla prover, av proven förhållanden är identiska, inklusive hydrering, rumstemperatur, och upptiningsprocessen, om så är lämpligt.
Det finns vissa begränsningar för de protokoll som presenteras. Studier har antytt att deformationsegenskaper av hud och brosk är beroende av preparatorientering 13. Hud erkändes att vara anisotropa så långt tillbaka som den 19: e århundradet, med Langer visar 1861 att huden har naturliga linjerav spänning, kallad Langer linjerna 4. När således karakterisera hudprover, är det viktigt att orientera alla prover parallellt eller vinkelrätt mot de Langer Lines att undvika att introducera en metod förspänning 4. Brosk visar också anisotropa egenskaper och innehåller Hultkrantz linjer, som är likvärdiga med Langer linjer, så brosket kan deformeras olika beroende på i vilken riktning den är laddad 12, 19. Således är det viktigt att öka provets storlek för att medge testning av brosk i olika riktningar. Som biomekaniska egenskaperna hos vävnad varierar också med ålder och kön, bör studier genomföras med ett representativt patientgruppen att bibehålla giltighet till den kliniska miljön. Vidare har vissa mekaniska protokoll språkar förkonditionering där vävnaden genomgår cyklisk belastning för att säkerställa att vävnaden är i ett stationärt tillstånd för efterföljande mekanisk provning 20. Emellertid den exakta mekanismen för prekonditionering är oklar och det exakta antalet cykler som behövs för att producera en konsekvent och repeterbar svar varierar i olika studier 20. Forskaren bör överväga huruvida inkludera förkonditionering efter att ha utvärderat orsaken till att utföra specifika biomekaniska testet 20.
Huden är ett komplext, flerskiktat material, delas in i tre huvudskikt: epidermis, dermis och hypodermis 4. De mekaniska egenskaperna hos hudvävnad har nyligen utvärderats med hjälp av in vivo bedömningar 4. Däremot kan protokoll från dragprovning användas för att förstå huden biomekanik utskuren hud 4. Sådana tester kan ge information för att modellera spänning-töjning relationer, eftersom de randvillkor kan definieras fyra. Typiskt, in vitro-regimer använder höga stammar för att karakterisera materialet att misslyckas, medan in vivo-system användslåg stam varierar 4. Vid jämförelse av biomekaniska värden för utskuren hud i spänning, finns det en stor variabilitet mellan olika studier, som sträcker sig från 2,9 till 150 MPa 4. Stora skillnader mellan individer förväntas på grund av naturliga biologiska variationer, men skillnader i protokoll regimer kan också förvärra dessa naturliga biologiska skillnader. Till exempel, kommer skillnader i lastningshastigheter mellan protokollen orsaka variation, eftersom större lastningshastigheter orsakar mindre tid för vätskan att strömma ut, vilket resulterar i en högre styvhet. Tillredningen, excision, och hanteringsprotokoll hudvävnaden kommer också orsaka skillnader i de mekaniska egenskaperna 4. Detta protokoll visat för att testa hud ger en alternativ metod för forskare att karakterisera vävnaden. Det ger några fördelar, inklusive möjligheten att identifiera de elastiska och viskoelastiska egenskaperna hos hudvävnad i ett mekaniskt test, vilket möjliggör en större förståelse för hudenunder en kort tid. Dessutom kan samma test tillämpas på vävnadstekniska ersättningar för att tillverka konstruktioner med liknande biomekaniska egenskaper som nativt hud.
Indrag test ger ett attraktivt alternativ jämfört med begränsad tryckprovning för att förstå biomekanik brosk 21. Inbuktning har förmågan att bevara den fysiologiska strukturen av brosket och således ger värden som efterliknar de hos en klinisk miljö. Med användning av indrag, är det också möjligt att testa brosket medan den fortfarande fäst till det underliggande benet. Inbuktning möjliggör också fysiologisk testning av brosk som in vivo. När två broskytorna närmar sig varandra, varvid kanterna som omger området för kontakt "bula" på grund av vatten under kontaktområdet förskjuts i sidled efter kompressiv deformation inträffar 17, 21. Brosk indrag måste genomföras med en iDAnge med en mindre radie än broskprov för att möjliggöra liknande utbuktning. Storleken på indenter bör också vara åtminstone 8 gånger provstorleken för att säkerställa att brosk reagerar som om det var en del av en obestämd prov 22. Använda en indenter mycket mindre än radien av prov diameter eliminerar kanteffekter som finns i provet skapas. Dessutom undviker indrag möjliga experimentella fel som orsakas av att testa broskskador som skadats av provet tas. Indrag också inte innebär förberedelse djup prov, exempelvis formpressning, så att små, tunna bitar av brosk som skall testas 17, 21. Dessutom icke-förstörande metod för fördjupningen innebär att den har en potentiell tillämpning i klinisk miljö som ett diagnostiskt verktyg efter validering och verifiering studier har utförts.
Det finns viktiga antaganden indrag som användaren måste säkerställa för appropriate resultat. En kritisk gräns tillstånd indrag belastning kräver ständig kontakt mellan indenter och broskytan (det vill säga att ytan inte deformeras bort från indenter) 23, 24. Indrag lastning innefattar också den antagna randvillkoret att kontakten mellan broskytan och indenter är icke-förstörande (innebärande att indenter är i kontakt med ytan, men inte går genom ytan; broskytan bör inte misslyckas under indenter) 25-26. Studier har visat att det kan kontrolleras detta randvillkor genom användning av tusch, som kommer att fläcka skadade områden när de appliceras på broskytan 25, 26. Ett ytterligare randvillkoret förutsätter att indenter komprimerar brosket vinkelrätt mot ytan av provet. Den vinkelräta orienteringen av kompressionen är en viktig gräns condition eftersom komprimering i en vinkel, särskilt om användning av cyklisk belastning, kan orsaka slirning, vilket kan inducera klippande komponenter och ändra mekanisk belastning. Detta tillstånd kan säkerställas genom noggrann testutrustning inrättas.
Efter de sammanfattade protokoll har optimerats för den mjuka vävnaden av intresse, skulle det vara användbart för forskare att undersöka dynamisk provning av vävnaden av intresse. Lämplig cyklisk laddning av prover bör efterlikna normala fysiologiska gränser och beteenden, till exempel härma promenader eller andra repetitiva rörelser 27. Sammanfattningsvis visar rapporten enkla mekaniska testprotokoll för att utvärdera mänskliga vävnader. Genomförandet av dessa protokoll kommer att ge viktig information om de biomekaniska egenskaperna hos vävnader, vilket möjliggör vävnadstekniska konstruktioner för att bättre efterlikna den naturliga vävnaden.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank the funding from Medical Research Council and Action Medical Research, which provided MG with a clinical fellowship, GN 2339, to conduct this work.
Digitial Vernier Calipers | Machine Mart | 40218046 | Digitial vernier caliper is used to measure sample thickness. |
Water Bath | Cole Parmer | UY-12504-94 | StableTemp Digital Water Bath Flask Holder used to defrost tissues samples if they are frozen. |
Mach-1 Material Testing Machine | Biomomentum | V500c | Mechanical Testing Machine used to test the mechancial properties of the tissues. |
Scalpel Blade | VWR | 233-5335 | Scalpel blades using to cut and dissect the tissues. |
Forceps | VWR | 470007-554 | Forceps used to dissect the tissues. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.2 | Life Technologies | 20012019 | PBS is used to hydate the tissue samples |