Plunge Nedfrysning: Et værktøj for Ultrastrukturelle og immunlokalisering Studier af Suspension Celler i Transmission Electron Microscopy
Summary
Dette manuskript beskriver en nem at bruge og billig cryofixation fremgangsmåde til visualisering suspensionsceller ved transmissionselektronmikroskopi.
Abstract
Transmission Electron Microscopy (TEM) er et ekstraordinært redskab til at studere celle ultrastruktur, for at lokalisere proteiner og visualisere makromolekylære komplekser med meget høj opløsning. Men for at komme så tæt som muligt på den naturlige tilstand, er perfekt prøve konservering påkrævet. Konventionel elektronmikroskopi (EM) fiksering med aldehyder, for eksempel, giver ikke god ultrastrukturel konservering. Den langsomme penetration fikseringer inducerer celle reorganisering og tab af forskellige cellekomponenter. Derfor er konventionelle EM fiksering ikke mulighed for en øjeblikkelig stabilisering og konservering af strukturer og antigenicitet. Det bedste valg for behandlingen intracellulære begivenheder er at bruge cryofixation efterfulgt af fryse-substitution fiksering metode, der holder cellerne i deres native tilstand. Højtryks-frysning / fryse-substitution, som bevarer integriteten af cellulær ultrastruktur, er den mest almindeligt anvendte metode, men kræver expensive udstyr. Her er en nem at bruge og billig fryse fiksering metode efterfulgt af fryse-substitution for suspension cellekulturer fremlagt.
Introduction
Prøve forberedelse er afgørende for succes i enhver elektronmikroskopi undersøgelse. Konventionel EM fiksering var den primære metode til fastsættelse væv eller celler til transmissionselektronmikroskopi (TEM) 1. Først aldehyder og osmiumtetroxid anvendes til kemisk fastgøre materialet ved stuetemperatur. Derefter er materialet dehydreret med organiske opløsningsmidler, infiltreret og indlejret i epoxyharpiks. Denne metode er afhængig af dækningsgraden fikseringer i cellen. Følgelig er artefakter og ekstraktion af cellulære indhold observeres sædvanligvis 2.
Cryofixation er klart en bedre alternativ til konservering af cellulære strukturer 3, holde dem intakt. Kan opnås den højeste kvalitet af TEM billeder 4 i tynde harpiksafsnit hjælp af cryofixation / fryse substitution metode. Formålet med denne teknik er at opnå forglasset biological prøver uden iskrystaller dannelse eller indeholder iskrystaller små nok til ikke at beskadige ultrastruktur af cellerne. Højtryks-frysning (HPF) og ultrahurtig cryofixation, som også kaldes springet frysning (PF), er to metoder til cryofix prøver. HPF immobiliserer molekyler i cellen går og undgår skader forårsaget af konventionel EM fiksering. Flere typer af frysemaskiner og automatiske substitutionsreaktioner indretninger er blevet udviklet 5. Indefrysningsforanstaltningerne maskiner og hjælpematerialer (flydende nitrogen, specimen bærere, etc.) er dyre, men de giver mulighed for fremstilling af høj kvalitet elektronmikrografier 6, 7. PF er en teknik, som blev anvendt i begyndelsen af 1950'erne og er beskrevet i litteraturen som enkel og billig 8 .Under PF fremgangsmåde udføres den forbehandlede prøve frosset ved en hurtig hastighed til opnåelse af iskrystaller på mindre end 3 og 5 nm. Til dette formål er prøvenkastet ud i en flydende kryogen, såsom ethan, propan, eller en ethan-propan-blanding. Siden 1950'erne har forbedringer af PF blevet gjort for at gøre denne teknik til rådighed for et større antal brugere. Højtryks-frysning er i øjeblikket den eneste måde, hvorpå at fryse en lang række prøver tykkere end 50 um (op til en tykkelse på 200 um for skiveformede prøver) 5, mens PF vidt omfang anvendes til at afbilde små genstande (<100 nm ), såsom makromolekylære komplekser suspenderet i en tynd film af amorf is 9. Større prøver, fx eukaryote celler, kan cryofixed af PF, men kræver prøveholder, såsom kapillær kobberrør eller sandwichsystemer 8, 10, 11.
Her, en hurtig, nem at bruge og billig springet frysning / fryse-substitution teknologi kan anvendes til forskellige suspension cellekulturer præsenteres.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM er en kraftfuld metode til ultrastrukturelle observation af organeller, celler og væv. Cryofixation / fryse-substitution er i øjeblikket den bedste metode til konservering af både ultrastruktur og protein antigenicitet. Kemiske fikseringsmidler trænge ind og virke meget langsomt hvorved strukturelle omlejringer før fuldstændig stabilisering af ultrastrukturen 2. Omvendt cryofixation / fryse-substitution øjeblikkeligt stabiliserer cellulære strukturer 4. Dog cry…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi udtrykker vores taknemmelighed til M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, og A. Devin for deres hjælp og kommentarer til manuskriptet. Vi er taknemmelige for den elektroniske billedbehandling pol af Bordeaux Imaging Center, hvor billederne blev taget. Dette arbejde blev støttet af Centre National de Recherche Scientifique.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
