डुबकी बर्फ़ीली: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में निलंबन कोशिकाओं के Ultrastructural और Immunolocalization अध्ययन के लिए एक उपकरण
Summary
यह पांडुलिपि संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा निलंबन कोशिकाओं दृश्यमान करने के लिए एक और उपयोग में आसान-कम लागत वाली cryofixation विधि का वर्णन है।
Abstract
ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) सेल अल्ट्राक्चर का अध्ययन करने के लिए एक असाधारण उपकरण है, ताकि प्रोटीन को स्थानांतरित किया जा सके और बहुत उच्च संकल्प पर मैक्रोमोलेकुलर कॉम्प्लेक्स का अनुमान लगाया जा सके। हालांकि, देशी राज्य के लिए जितना करीब हो सके, सही नमूना संरक्षण आवश्यक है। उदाहरण के लिए, एल्डिहाइड के साथ परंपरागत इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) निर्धारण, अच्छा अल्टरस्ट्रक्चर संरक्षण प्रदान नहीं करता है। फिक्सिस्टिक्स के धीमे गति से सेल पुनर्गठन और विभिन्न सेल घटकों के नुकसान को प्रेरित करता है। इसलिए, पारंपरिक ईएम निर्धारण एक तात्कालिक स्थिरीकरण और संरचनाओं और प्रतिजन के संरक्षण की अनुमति नहीं देता है। इंट्रासेल्युलर घटनाओं की जांच करने के लिए सबसे अच्छा विकल्प रिक्ति-प्रतिस्थापन निर्धारण पद्धति के बाद क्रिस्टीशन का उपयोग करना है जो अपने मूल अवस्था में कोशिकाओं को रखता है। उच्च दबाव ठंड / फ्रीज-प्रतिस्थापन, जो सेलुलर मूलभूत संरचना की अखंडता को सुरक्षित रखता है, यह सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है, लेकिन इसकी आवश्यकता हैउपकरण किया है। यहाँ एक और उपयोग में आसान-कम लागत वाली फ्रीज निर्धारण विधि निलंबन कोशिका संवर्धन के लिए फ्रीज प्रतिस्थापन के बाद प्रस्तुत किया है।
Introduction
किसी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी अध्ययन की सफलता के लिए नमूना तैयार करना महत्वपूर्ण है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) 1 के लिए ऊतक या कोशिकाओं को फिक्स करने के लिए पारंपरिक ईएम निर्धारण प्राथमिक विधि था। सबसे पहले, एल्डिहाइड और ऑस्मियम टेट्रोक्साइड का उपयोग कमरे के तापमान पर रासायनिक पदार्थों को ठीक करने के लिए किया जाता है। फिर, सामग्री कार्बनिक सॉल्वैंट्स के साथ निर्जलित है, घुसपैठ, और एपॉक्सी राल में एम्बेडेड है। यह विधि सेल में फिक्सिव्स के प्रवेश दर पर निर्भर है। नतीजतन, सेल्युलर सामग्री की कलाकृतियों और निष्कर्षण आमतौर पर 2 देखे जाते हैं।
सेलुलर संरचनाओं के संरक्षण के लिए स्पष्ट रूप से एक बेहतर विकल्प 3 , उन्हें बरकरार रखना Cryomyation / फ्रीज प्रतिस्थापन विधि का उपयोग करके पतली राल खंडों में मंदिरों की उच्चतम गुणवत्ता 4 प्राप्त की जा सकती है। इस तकनीक का उद्देश्य वर्थिफाइड द्वि प्राप्त करना हैबर्फ के क्रिस्टल गठन या युक्त बर्फ के क्रिस्टल काफी छोटा कोशिकाओं के फैटी नुकसान न बिना ological नमूने हैं। उच्च दबाव ठंड (HPF) और अति तीव्र cryofixation है, जो भी ठंड (पीएफ) डुबकी कहा जाता है, नमूने cryofix करने के लिए दो तरीके हैं। HPF तत्क्षण सेल में अणुओं immobilizes और पारंपरिक ईएम निर्धारण के कारण नुकसान से बचा जाता है। ठंड मशीनों और स्वत: प्रतिस्थापन उपकरणों के कई प्रकार विकसित किया गया है 5। ठंड मशीनों और उपभोज्य (तरल नाइट्रोजन, वाहक नमूना आदि) महंगे हैं, लेकिन वे उच्च गुणवत्ता वाले इलेक्ट्रॉन micrographs 6, 7 के उत्पादन के लिए अनुमति देते हैं। पीएफ एक तकनीक है कि 1950 के दशक में इस्तेमाल किया गया था और के रूप में सरल और सस्ते 8 पीएफ प्रक्रिया के दौरान, तैयार नमूना एक तेजी से दर पर जमे हुए है प्राप्त करने के लिए बर्फ के क्रिस्टल कम से कम 3 से 5 एनएम आकार साहित्य में वर्णित किया गया है। इस उद्देश्य के लिए नमूना हैएक तरल cryogen में कूद गया, जैसे कि ईथेन, प्रोपेन, या एथेन-प्रोपेन मिश्रण। 1 9 50 के दशक से, इस तकनीक को उपयोगकर्ताओं की एक बड़ी संख्या में उपलब्ध कराने के लिए पीएफ के सुधार किए गए हैं। उच्च दबाव ठंड वर्तमान में केवल 50 माइक्रोन (डिस्क आकार के नमूनों के लिए 200 माइक्रोन की मोटाई तक) की तुलना में अधिक मोटी नमूनों की एक विशाल विविधता को फ्रीज करने का एकमात्र व्यवहार्य तरीका है, जबकि पीएफ व्यापक रूप से छवि छोटी वस्तुओं (<100 एनएम ), जैसे मैक्रोमोलेकुलर कॉम्प्लेक्स को अनाकार की 9 पतली फिल्म में निलंबित कर दिया गया उदाहरण के लिए बड़े नमूने, यूकेरियोटिक कोशिकाओं को पीएफ द्वारा रोशन किया जा सकता है, लेकिन नमूना धारकों की आवश्यकता होती है, जैसे केशिका तांबे ट्यूब या सैंडविच सिस्टम 8 , 10 , 11 ।
यहां, विभिन्न निलंबन सेल संस्कृतियों के लिए एक तेज़, आसान उपयोग और कम लागत वाली डुबकी फ्रीजिंग / फ़्रीज-प्रतिस्थापन तकनीक का उपयोग किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM अंगों, कोशिकाओं और ऊतकों की ultrastructural अवलोकन के लिए एक शक्तिशाली तरीका है। Cryofixation / फ्रीज प्रतिस्थापन वर्तमान में दोनों फैटी और प्रोटीन प्रतिजनकता के संरक्षण के लिए सबसे अच्छा तरीका है। रासायनिक fixatives घुसन?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम उनकी मदद और पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए एम Bouchecareilh, ई Tétaud, एस Duvezin-Caubet, और ए डेविन के लिए हमारी कृतज्ञता व्यक्त करते हैं। हम बोर्डो इमेजिंग सेंटर के इलेक्ट्रॉनिक इमेजिंग ध्रुव जहां छवियों ले जाया गया के आभारी हैं। यह काम केंद्र राष्ट्रीय डी ला Recherche Scientifique द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
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