Plunge Invriezen: een instrument voor de Ultrastructureel en immunolokalisatiestudies van Suspension Cellen in Transmission Electron Microscopy
Summary
Dit handschrift beschrijft een gemakkelijk te gebruiken en goedkope Cryofixatie werkwijze voor het zichtbaar suspensiecellen door transmissie- elektronenmicroscopie.
Abstract
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is een buitengewone hulpmiddel voor het bestuderen van cel ultrastructuur, om eiwitten te lokaliseren en te visualiseren macromoleculaire complexen bij zeer hoge resolutie. Echter, om zo dicht mogelijk bij de oorspronkelijke staat te krijgen, is perfect monster- conservering vereist. Conventionele elektronenmicroscopie (EM) fixatie met aldehyden, bijvoorbeeld, biedt geen goede ultrastructurele bewaring. De langzame penetratie van fixatieven induceert cel reorganisatie en het verlies van de verschillende celcomponenten. Daarom is de conventionele EM fixatie niet zorgen voor een onmiddellijke stabilisatie en behoud van structuren en antigeniciteit. De beste keuze voor de behandeling van intracellulaire gebeurtenissen op Cryofixatie gevolgd door vries-substitutie fixatiemethode dat cellen houdt in hun natieve toestand te gebruiken. Hoge druk invriezen / vries-substitutie, die de integriteit van cellulaire ultrastructuur behoudt, is de meest gebruikte methode, maar vereist expensive apparatuur. Hier wordt een eenvoudig te gebruiken en goedkope vries fixatiemethode gevolgd door vries-substitutie voor suspensie celkweken gepresenteerd.
Introduction
Monster voorbereiding is van cruciaal belang voor het succes van een elektronenmicroscopie studie. EM conventionele fixatie was de primaire methode voor het bevestigen van weefsels of cellen voor transmissie elektronenmicroscopie (TEM) 1. Eerst, aldehyden en osmiumtetroxide worden gebruikt om het materiaal bij kamertemperatuur chemisch oplossen. Daarna wordt het materiaal met organische oplosmiddelen gedehydrateerd, geïnfiltreerd en ingebed in epoxyhars. Deze werkwijze is afhankelijk van de penetratiegraad van fixatieven in de cel. Bijgevolg worden de artefacten en winning van celinhoud meestal waargenomen 2.
Cryofixatie is duidelijk een beter alternatief voor het behoud van cellulaire structuren 3, waardoor ze intact. De hoogste kwaliteit van TEM beelden 4 in dunne harssecties kunnen worden verkregen met de Cryofixatie / vries substitutiemethode. Het doel van deze techniek is om verglaasd bi verkrijgensche monsters zonder ijskristallen vormen of met ijskristallen klein genoeg de ultrastructuur van de cellen te beschadigen. Hoge druk invriezen (HPF) en ultrasnelle Cryofixatie, die ook wel plunge freezing (PF), op twee manieren monsters cryofix. HPF immobiliseert moleculen in de cel onmiddellijk en voorkomt schade door conventionele EM fixatie. Verschillende soorten bevriezen machines en automatische vervanging apparaten zijn ontwikkeld 5. Bevriezing machines en materialen (vloeibare stikstof, monsterdragers, etc.) zijn duur, maar ze zorgen voor de productie van hoogwaardige elektronmicrografen 6, 7. PF is een techniek die gebruikt werd in de vroege jaren 1950 en in de literatuur beschreven als eenvoudige en goedkope 8 .Tijdens de PF procedure wordt het voorbereide monster bevroren bij een hoge snelheid te verkrijgen ijskristallen kleiner dan 3 tot 5 nm. Daartoe wordt het monsterondergedompeld in een vloeibaar cryogeen, zoals ethaan, propaan, of een etheen-propeen-mengsel. Sinds de jaren 1950 zijn er verbeteringen van PF gedaan om deze techniek beschikbaar te maken voor een groter aantal gebruikers. Hogedruk vriezen is momenteel de enige werkbare manier om een groot aantal monsters te bevriezen dikker dan 50 urn (tot een dikte van 200 urn voor schijfvormige monsters) 5, terwijl PF grote schaal wordt gebruikt voor beeldvorming kleine voorwerpen (<100 nm ) zoals macromoleculaire complexen gesuspendeerd in een dunne film van amorf ijs 9. Grotere monsters, bijvoorbeeld eukaryote cellen, kunnen worden cryofixed PF, maar vereist monsterhouders, zoals capillaire buizen of koper sandwichsystemen 8, 10, 11.
Hier een snelle, eenvoudig te gebruiken en voordelig plunge freezing / vries-substitutie technologie geschikt voor diverse suspensie celkweken gepresenteerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM is een krachtige methode voor ultrastructurele waarneming van organellen, cellen en weefsels. Cryofixatie / vries-substitutie is momenteel de beste methode voor het behoud van zowel ultrastructuur en eiwitten antigeniciteit. Chemische fixatieven penetreren en handelen langzaam waardoor structurele herschikkingen vóór de volledige stabilisatie van de ultrastructuur 2. Omgekeerd Cryofixatie / vries-substitutie stabiliseert direct cellulaire structuren 4. Echter, Cryofi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij spreken onze dank uit aan M. Bouchecareilh, E. Tétaud, S. Duvezin-Caubet, en A. Devin voor hun hulp en opmerkingen over de manuscript. We zijn dankbaar voor de elektronische beeldvorming pool van Bordeaux Imaging Center waar de beelden werden genomen. Dit werk werd ondersteund door het Centre National de la Recherche Scientifique.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
