暴跌冻结：在透射电子显微镜的超微结构和免疫组化研究工具悬架细胞
Summary
此手稿描述了通过透射电子显微镜可视化用混悬剂细胞中易于使用和低成本的冷冻固定方法。
Abstract
透射电子显微镜（TEM）是研究细胞超微结构，以本地化的蛋白质和以非常高的分辨率可视化大分子复合物不平凡的工具。但是，要获得尽可能接近原生状态，需要完善的样品保存。与醛常规电子显微镜（EM）固定，比如，不能提供良好的超微结构保存。固定剂的缓慢渗透诱导细胞重组和各种细胞成分的损失。因此，常规EM固定不允许结构和抗原性的瞬时稳定和保存。审查细胞内事件的最佳选择是使用冷冻固定，然后，保持细胞的天然状态的冷冻替代固定方法。高压冷冻/冻干取代，其保留细胞的超微结构的完整性，是最常用的方法，但需要expensi已经装备。这里，易于使用和低成本的冷冻固定方法进行冷冻取代悬浮细胞培养物呈现。
Introduction
样品制备为任何电子显微镜研究成功的关键。常规EM固定是用于固定的组织或细胞进行透射电子显微镜（TEM）1的主要方法。首先，醛和四氧化锇用于化学固定在室温下该材料。然后，将材料脱水用有机溶剂，渗透，并包埋在环氧树脂中。此方法取决于固定剂的渗透速率进入细胞。因此，细胞内容物中的工件和提取通常被观察到2个。
冷冻固定显然是细胞结构3保存一个更好的选择，让他们完好。可以使用冷冻固定/冷冻置换方法来获得在薄树脂切片TEM图像4的最高质量。这种技术的目的是为了获得玻璃化的双ological样品没有冰晶形成或含有冰晶小到足以不损伤细胞的超微结构。高压冷冻（HPF）和超快速冷冻固定，其也被称为切入冷冻（PF），两种方法来cryofix样品。 HPF在单元固定不动的分子瞬时且避免了由常规EM固定的损害。几种类型的冷冻机和自动替换设备已经开发5。冷冻机器和消耗品（液氮，标本的载体，等等）是昂贵的，但它们允许生产高品质的电子显微照片6,7。 PF是已在50年代初采用和在文献中简单和便宜8 .During的PF程序，将制备的样品以很快的速度冷冻，得到冰晶尺寸小于3至5nm，描述了一种技术。为此，所述样品是陷入液态制冷剂，如乙烷，丙烷，或乙烷 – 丙烷混合物。自50年代以来，PF的改进已经完成，以使这项技术提供给用户更大的数字。高压冷冻目前冻结大量的各种样品的厚度大于50微米（最多为盘形样品的厚度为200微米）5的唯一可行的办法，而PF被广泛地用于图像的小物体（<100nm的），如悬浮于无定形冰9的薄膜大分子复合物。较大的样品，例如真核细胞，可以通过PF cryofixed，但需要试样保持器，如毛细管铜管或三明治系统8，10，11。
这里，快速，易于使用和可用于各种悬浮细胞培养物的低成本暴跌冷冻/冻干替代技术被呈现。
Protocol
1.福尔瓦网格薄膜的制备注意：在使用个人防护设备（手套，实验室外套，眼镜）在通风橱下执行氯仿操纵。使用400个目电子显微镜铜网格。与其他类型的网格（其它的网孔尺寸，金和镍网格），冷冻的质量较差。 制备0.3％的聚乙烯醇缩甲醛的氯仿100mL的溶液。允许不搅拌溶解过夜。 把400目在玻璃小瓶中电子microscopycopper网格（直径3.05毫米）（高度为3厘米，直?…
Representative Results
在本文中，提出了一种用于超微结构（ 图1和图2）和免疫标记（ 图3）的研究一种易于使用和低成本的暴跌冷冻方法。我们证明，这是没有必要有专用设备冷冻置换程序，该程序升温只需不到6个小时，而不是使用专用系统的24个小时。 PF /冷冻置换方法导致在<…
Discussion
TEM是细胞器，细胞，和组织的超微结构观测的有效方法。冷冻固定/冷冻取代是目前两种超微结构和蛋白的抗原性的保存的最佳方法。化学固定剂渗透和行动非常缓慢，从而使结构重组的超微结构2的完全稳定之前。相反，冷冻固定/冷冻置换瞬间稳定蜂窝结构4。然而，冷冻固定/冷冻替代技术包括了许多限制和困难从而限制了它们的应用范围的。这涉及样品，冷?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们对此表示感谢M. Bouchecareilh，E.Tétaud，S. Duvezin-Caubet和A.德文的帮助和意见的手稿。我们非常感谢何地拍摄的图像波尔多成像中心的电子成像极。这项工作是由中心法国国家科学研究的支持。
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
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Cite This Article
Blancard, C., Salin, B. Plunge Freezing: A Tool for the Ultrastructural and Immunolocalization Studies of Suspension Cells in Transmission Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (123), e54874, doi:10.3791/54874 (2017).