Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori

Bogumila Swietek; Akshay Gupta; Archana Proddutur; Vijayalakshmi Santhakumar

doi:10.3791/54880

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Articolo metodologico

Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori

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DOI:

10.3791/54880

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31 dicembre 2016

Bogumila Swietek¹ , Akshay Gupta² , Archana Proddutur² , Vijayalakshmi Santhakumar²

¹Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, ²Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo per il recupero morfologica dei neuroni rattoppati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando riempimento biocitina e successiva postprocessing immunoistochimica. Abbiamo dimostrato che spesse sezioni biocitina-riempita che erano macchiate e coprioggetto possono essere ricolorate con un secondo giorni di anticorpi primari o mesi dopo.

Abstract

registrazioni elettrofisiologiche di cellule utilizzando la tecnica del patch clamp hanno permesso l'identificazione di diversi tipi neuronali basate su modelli di cottura. L'inclusione di biocitina / neurobiotin nel elettrodo di registrazione permette il recupero post-hoc dei dettagli morfologici, che sono necessari per determinare la arborizzazione dendritiche e le regioni interessate dagli assoni dei neuroni registrati. Tuttavia, data la presenza di neuroni morfologicamente simili con identità distinte neurochimiche e funzioni, colorazione immunoistochimica per le proteine-specifica delle cellule-tipo è essenziale per identificare definitivamente i neuroni. Per mantenere la connettività di rete, sezioni di cervello per le registrazioni fisiologiche sono preparati ad uno spessore di 300 micron o superiore. Tuttavia, questo spessore spesso ostacola la post-elaborazione immunoistologiche causa di problemi con la penetrazione degli anticorpi, che richiede la resezione del tessuto. Resezione di fette è un'arte difficile, spesso Resulting nella perdita di tessuto e la morfologia delle cellule da cui sono stati ottenuti i dati elettrofisiologici, rendendo i dati inutilizzabili. Poiché il recupero della morfologia limiterebbe perdita di dati e guida nella scelta dei marcatori neuronali, abbiamo adottato una strategia di recuperare morfologia cellulare prima, seguita da immunocolorazione secondaria. Introduciamo un approccio pratico per biocitina riempimento durante le registrazioni fisiologiche e successiva immunostaining seriale per il recupero di morfologia, seguita dalla restaining delle sezioni per determinare l'identità neurochimico. Si segnala che le sezioni che erano pieni di biocitina, fissate con paraformaldeide (PFA), macchiati, e coprioggetto possono essere rimossi e ricolorate con un secondo anticorpo primario giorni successivi. Questo restaining comporta la rimozione del vetrino, il lavaggio delle sezioni in una soluzione tampone, e l'incubazione di anticorpi primari e secondari per rivelare l'identità neurochimico. Il metodo è vantaggioso per eliminare datuna perdita a causa di una incapacità di recuperare la morfologia e per restringendo i marcatori neurochimici da sottoporre a test sulla base di morfologia.

Introduzione

Il cervello è noto per la diversità nelle caratteristiche strutturali e funzionali dei singoli elementi neuronali. La comprensione dei ruoli di tipi neuronali distinti in funzione del cervello e patologia richiede caratterizzazione e identificazione univoca dei neuroni. Strutturalmente, le caratteristiche morfologiche definite dalla posizione somato-dendritiche determinare il potenziale di input che riceve un dato neurone, mentre il modello di arborization assonale identifica potenziali obiettivi post-sinaptici. La diversità strutturale dei neuroni è stato apprezzato fin dai tempi di seminali studi istologici di Ramon y Cajal ^1. L'avvento di tecniche d....