Ökad Återhämtningstid och minskade LPS administration att studera vagusnerven stimulering mekanismer i begränsade inflammatoriska svar
Summary
Vagus nerve stimulation has proven to have a strong efficacy for decreasing peripheral inflammation. Here, we present a modified vagus nerve stimulation protocol that allows for further examinations of the cholinergic anti-inflammatory mechanisms in limited inflammatory responses.
Abstract
Inflammation is a local response to infection and tissue damage mediated by activated macrophages, monocytes, and other immune cells that release cytokines and other mediators of inflammation. For a long time, humoral and cellular mechanisms have been studied for their role in regulating the immune response, but recent advances in the field of immunology and neuroscience have also unraveled specific neural mechanisms with interesting therapeutic potential. The so-called cholinergic anti-inflammatory pathway (CAP) has been described to control innate immune responses and inflammation in a very potent manner. In the early 2000s, Tracey and collaborators developed a technique that stimulates the vagus nerve and mimics the effect of the pathway. The methodology is based on the electrical stimulation of the vagus nerve at low voltage and frequency, in order to avoid any side effects of overstimulation, such as deregulation of heart rate variability. Electrical devices for stimulation are now available, making it easy to set up the methodology in the laboratory. The goal of this research was to investigate the potential involvement of prostaglandins in the CAP. Unfortunately, based on earlier attempts, we failed to use the original protocol, as the induced inflammatory response either was too high or was not suitable for enzymatic metabolism properties. The different settings of the original surgery protocol remained mostly unchanged, but the conditions regarding inflammatory induction and the time point before sacrifice were improved to fit our purposes (i.e., to investigate the involvement of the CAP in more limited inflammatory responses).
The modified version of the original protocol, presented here, includes a longer time range between vagus nerve stimulation and analysis, which is associated with a lower induction of inflammatory responses. Additionally, while decreasing the level of lipopolysaccharides (LPS) to inject, we also came across new observations regarding mechanistic properties in the spleen.
Introduction
Medfödd immunitet ger en omedelbar första försvarslinje mot infektioner och sjukdomar i ett brett spektrum av organismer. Det initierar inte bara det primära immunsvaret för att eliminera hotet, men det spelar också en central roll i att aktivera och utbilda den adaptiva immunitet som utför sekundära immunsvar hos en patogen-specifikt sätt. Inflammation är iscensatt av en uppsjö av cytokiner och kemokiner, vilka i sin tur har förmåga att attrahera andra immunceller till platsen för infektion och för att inducera kardinal tecken på inflammation, såsom rodnad, svullnad, smärta, förlust av funktion, och feber . Varaktighet och intensitet av inflammation beror på flera faktorer, men lösa inflammation och återställa homeostas är ett kritiskt steg för att undvika uppkomsten av kroniska inflammatoriska sjukdomar. Nya framsteg inom neurovetenskap och immunologi har unraveled specifika neurala mekanismer med enorm terapeutisk potential för att styra inflammation både i det centrala nervsystemet och i periferin. En av dessa mekanismer är den kolinerga antiinflammatoriska vägen (CAP), även känd som den inflammatoriska reflex, som drivs av det autonoma nervsystemet 4, 5.
Det är för närvarande tänkt att inflammatoriska mediatorer aktiverar sensoriska nerver och skicka signaler om tillståndet av inflammation till det centrala nervsystemet. En reflexsvar aktiveras sedan genom den efferenta vagusnerven. En omfattande studie om de anatomiska detaljerna i CAP har avslöjat en parasympatiska-sympatisk modell består av två nerver, vagusnerven och mjälten nerv, respektive 6. I CAP, den aktiverade kolinerga efferenta vagusnerven slutar i celiaki-mesenteriska ganglion, vilket resulterar i aktivering av den adrenerga mjälten nerven genom en mekanism som kommer att utforskas. Mjälten nerv, sålunda aktiverade, är känd för att inrevate i nära anslutning till immunceller i den vita massan, marginell zon, och röd pulpa av mjälte, den viktigaste och obligatorisk organ i CAP 7, 8. Norepinefrin (NE) från mjält nervändar binder till de motsvarande β 2-adrenerga receptorer uttryckta på mjält-T-lymfocyter. Detta inducerar kolinacetyltransferas (ChAT) -medierad acetylkolin (ACh) frisättning, vilket i sin tur aktiverar a7-nikotinacetylkolinreceptorer (α7nACh) på makrofager, därigenom begränsande cytokinproduktion och inflammation 2. Följaktligen är det nu klart att nervsystemet kan reglera inflammation i perifera vävnader och återställa lokala immun homeostas.
Som namnet på vägen antyder är ACh-systemet av central betydelse för tillämpningen av detta neuro-immuna reglervägen. Intressant, mekanismer som är involverade i aktiveringen avCAP verkar vara olika i periferin och i det centrala nervsystemet. Medan vikten av nikotinreceptorer (α7nAChR) i mjälten har påvisats tidigare 9, muskarinreceptorer (mAChR) är obligatoriska för den centrala aktivering av reaktionsvägen 10, 11. Mer nyligen, perifer administrering av en centralt verkande M1 muskarinagonist signifikant undertryckta i serum och mjälte tumörnekrosfaktor α (TNFa) under letal murin endotoxemi, en åtgärd som krävs intakt vagusnerv och mjält nerv signalering 12. Vi har också visat nyligen att möss som saknar prostaglandin E2 (PGE2) kunde inte svara på vagusnerven stimulering och inte nedreglera LPS-inducerad frisättning av cytokiner i serum och mjälte 3. Därför kan den gemensamma jordbrukspolitiken också regleras av andra än huvud ACh pathw systemay.
Vagusnerven har utsetts som sådan på grund av dess vandrande kurs i kroppen, innervating huvudorgan, inklusive lever, lungor, mjälte, njurar och tarm 13. Med tanke på denna stora innervation och mycket potent immunsuppressiv effekt av vagusnerven kan den terapeutiska potentialen hos den gemensamma jordbrukspolitiken omfattar ett brett spektrum av inflammatoriska tillstånd. Vagusnerven kan vara elektriskt (eller mekaniskt) aktiveras, med kontroll över spänning och frekvens, och i motsats till konventionell behandling, utan läkemedel läggas till kroppen. Prövningar pågår i reumatiska patienter, till exempel för att testa den kliniska betydelsen av VNS för behandling av kronisk inflammation 14. Helt och hållet, den neuro-immuna kommunikation och reglering av inflammation är för närvarande under utredning, vilket kommer att ge ett möjligt alternativ behandling till konventionell terapi. Därför, analys av vagusnerven stimuleringn effekt i de olika innerverade organ, men även karakterisering av potentiella terapeutiska verkan i djurmodeller av kronisk inflammation, skulle definitivt ge insikter och hoppas på nya potentiella terapeutiska mål.
Den ursprungliga metod som utvecklats av Tracey och kollegor 4 kunde inte överföras till vårt forskningsområde på grund av överstimulering av det inflammatoriska svaret (med en dödlig dos av LPS) och en alltför kort tidsintervall mellan CAP aktivering och avläsning. I föreliggande papper, kommer vi att presentera de ändringar som gjorts till den ursprungliga protokollet, jämföra de två olika metoder på cytokinnivåer, och markera en ny och motsatt observation på målorganet (mjälten).
Protocol
Representative Results
Discussion
Sedan dess upptäckt i början av 2000-talet mekanismerna för CAP har studerats ingående. Vi har nu en god bild av vägen, och i synnerhet, målorganet, mjälten, där NE, minne T-celler, Ach, och makrofager fungerar som ett mycket effektivt team för att nedreglera inflammatoriska mediatorer 2. Vi har också nyligen publicerade data om vikten av ett funktionellt prostaglandinsystemet hos möss, i synnerhet, PGE 2, vilket naturligtvis är en obligatorisk komponent för ACh-frigöring…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The study was supported by the Swedish Research Council, the Swedish Rheumatism Asociation, Karolinska Institute Foundations, Stockholm County Council, The Wallenberg Foundation, and the GV 80 Years’ Foundation for research. The authors would also like to thank Hannah Aucott for proofreading the manuscript.
Materials
| Computer | Toshiba | – | Any computer is actually compatible |
| MP-150 data acquisition system | Biopac Systems | MP150WSW | |
| Acknowledge software | Biopac Systems | ||
| Mice C57Bl/6 | Charles River | ||
| Anesthetic machine | Simtec Engineering | ||
| Medical oxygen bottle | AGA | 107563 | |
| Medical air bottle | AGA | 108639 | |
| Vetflurane (1000mg/g) | Virbac | 137317 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| Saline | Merck Millipore | 1024060080 | |
| PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493 | Diluted 10 times for used concentration |
| Syringe (1 ml) | BD Plastipak | 303172 | |
| Needles 23G | KD-FINE | 900284 | 0.6 x 30 mm (blue) |
| Microdissecting forceps (curved) | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Dissecting scissors | Sigma-Aldrich | Z265969 | |
| Surgical suture 4-0 | Ethicon | G667G | |
| Euthanasia unit | Euthanex Smartbox | EA-32000 | |
| Cavilon No Sting Barrier Film | 3M Health Care | 3346N | |
| TH1/TH2 9-Plex assay, ultrasensitive kit | MesoScale Discovery | K15013C-1 |
References
- Nathan, C. Points of control in inflammation. Nature. 420 (6917), 846-852 (2002).
- Rosas Ballina, M., et al. Acetylcholine-synthesizing T cells relay neural signals in a vagus nerve circuit. Science. 334 (6052), 98-101 (2011).
- Le Maître, E., et al. Impaired vagus-mediated immunosuppression in microsomal prostaglandin E synthase-1 deficient mice. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 121 (Part B), 155-162 (2015).
- Borovikova, L. V., et al. Vagus nerve stimulation attenuates the systemic inflammatory response to endotoxin. Nature. 405 (6785), 458-462 (2000).
- Olofsson, P. S., Rosas-Ballina, M., Levine, Y. A., Tracey, K. J. Rethinking inflammation: neural circuits in the regulation of immunity. Immunol. Rev. 248 (1), 188-204 (2012).
- Pavlov, V. A., Tracey, K. J. Neural circuitry and immunity. Immunol Res. 63 (1-3), 38-57 (2015).
- Huston, J. M., et al. Splenectomy inactivates the cholinergic antiinflammatory pathway during lethal endotoxemia and polymicrobial sepsis. J. Exp. Med. 203 (7), 1623-1628 (2006).
- Rosas-Ballina, M., et al. Splenic nerve is required for cholinergic anti-inflammatory pathway control of TNF in endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (31), 11008-11013 (2008).
- Wang, H., et al. Nicotinic acetylcholine receptor alpha7 subunit is an essential regulator of inflammation. Nature. 421 (6921), 384-388 (2003).
- Pavlov, V. A., et al. Central muscarinic cholinergic regulation of the systemic inflammatory response during endotoxemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (13), 5219-5223 (2006).
- Pavlov, V. A., et al. Brain acetylcholinesterase activity controls systemic cytokine levels through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Brain Behav. Immun. 23 (1), 41-45 (2009).
- Rosas-Ballina, M., et al. Xanomeline suppresses excessive pro-inflammatory cytokine responses through neural signal-mediated pathways and improves survival in lethal inflammation. Brain Behav. Immun. 44, 19-27 (2014).
- Bellinger, D. L., Lorton, D., Lubahn, D., Felten, D. L., Ader, R., Felten, D. L., Cohen, N. . Psychoneuroimmunology. 55, 55-112 (2001).
- Andersson, U., Tracey, K. J. A new approach to rheumatoid arthritis: treating inflammation with computerized nerve stimulation. Cerebrum. 2012, 3 (2012).
- Ono, S. J., Nakamura, T., Miyazaki, D., Ohbayashi, M., Dawson, M., Toda, M. Chemokines: Roles in leucocyte development, trafficking, and effector function. J. Allergy Clin. Immunol. 111 (6), 1185-1199 (2003).
- Silvestre-Roig, C., Hidalgo, A., Soehnlein, O. Neutrophil heterogeneity: implications for homeostasis and pathogenesis. Blood. , (2016).
- Matteoli, G., Boeckxstaens, G. E. The vagal innervation of the gut and immune homeostasis. Gut. 62, 1214-1222 (2013).
- Pereira, M. R., Leite, P. E. The involvement of parasympathetic and sympathetic nerve in the inflammatory reflex. J. Cell. Physiol. 231, 1862-1869 (2016).
- Levine, Y. A., et al. Neurostimulation of the cholinergic anti-inflammatory pathway ameliorates disease in rat collagen-induced arthritis. PLoS One. 9 (8), e104530 (2014).
- Huston, J. M., et al. Transcutaneous vagus nerve stimulation reduces serum high mobility group box 1 levels and improves survival in murine sepsis. Crit. Care Med. 35 (12), 2762-2768 (2007).
- Yuan, H., Silberstein, S. D. Vagus nerve and vagus nerve stimulation, a comprehensive review: Part II. Headache. 56 (2), 259-266 (2016).
