Colon-26 РАК-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ мышь в качестве модели для изучения рака кахексия
Summary
Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.
Abstract
Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.
Introduction
Атрофия мышц является серьезным осложнением различных клинических состояний, таких как рак, сепсис, печени, цирроз печени, сердца и почечной недостаточности, хронической обструктивной болезни легких и СПИД. В частности, истончение мышц очевидно , по крайней мере , у 50% пациентов с раком 1. Потеря скелетных мышц в результатах рака с повышенной деградации белка из – за чрезмерной активации скелетных мышц системы протеолитических и / или из -за снижения синтеза белка 6. Липолиз также очевидно, что приводит к истощению жировой ткани. Клинически, кахексия связано со снижением качества и продолжительности жизни , и, по оценкам, причиной смерти в 20 – 30% раковых больных 7. Использование экспериментальных моделей, которые напоминают человеческую болезнь настолько близко, насколько это возможно было бы полезно. Оптимальная модель животного характеризуется высокой воспроизводимостью, а также ограниченного вмешательства со стороны различных терапий и непредсказуемых факторовдиеты, секс, и генетический фон, которые обычно связаны с клиническим состоянием 8. До сих пор, раковая кахексия изучено в основном в моделях на животных, характеризующихся трансплантацией раковых клеток или инъекции канцерогенов, хотя новый метод состоит в использовании генетически модифицированных мышей, восприимчивых к развитию рака.
Мыши , несущие C26 карциномы (также упоминается как двоеточие-26 и аденокарциномы) представляют собой хорошо охарактеризованных и широко используемой моделью раковая кахексия 2,5. Рост результатов опухоли С26 в организме и потере мышечной массы тела, в основном за счет расширения жира и белка катаболизма 9. Как правило, вес опухоли на 10% по отношению к общей массы тела ассоциируется с уменьшением на 20-25% в скелетной мышечной массы и большим истощением жира 3,10. Гепатомегалии и спленомегалии наблюдаются с ростом опухоли, наряду с активацией ответной реакции острой фазы и возвышения про-Inflammatory уровни цитокинов 3,11. Среди них, как хорошо известно , что IL-6 играет ключевую роль в опосредовании атрофию мышц в модели C26, даже если этот цитокин, вероятно , не только индуктором кахексии 12. Повышенные ИЛ-6 вызывает атрофию мышц за счет активации пути JAK / STAT3, и ингибирующих этот фактор транскрипции может предотвратить атрофии мышц 3,4.
Во время С26-индуцированной атрофии мышц, как и во многих условиях атрофии мышц, мышечная масса теряется в основном за счет сокращения содержания мышечного белка через мышечных волокон, а не через смерть или потерю волокон 13 клеток. В C26 кахексии, сдвиг в сторону меньших площадей поперечного сечения наблюдается в обоих гликолитических и окислительных волокон 2. Это также согласуется с пониженной мышечной силы 5. Многие группы по всему миру воспользовались модели C26 с целью выявления новых медиаторов атрофии мышц или клинически значимых препаратов для ККА ракаhexia. Тем не менее, множество различных процедур для использования этой модели было зарегистрировано, вызывает обеспокоенность по поводу согласованности полученных данных и создает барьеры для воспроизводимости в различных экспериментальных условиях. Здесь мы сообщаем типичное использование этой модели для изучения кахексии рака, который дает стандартизированные и воспроизводимые данные.
Protocol
Representative Results
Discussion
Особенно в его поздних стадиях, колоректальный рак связан с развитием кахексии, которая отвечает за худшим результатам и снижению качества жизни пациентов. Многие исследования были сосредоточены на лечении состояний, вторичной по отношению к раку; Однако, несмотря на многочисленные у…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Richard Lieber and Shannon Bremner for their ImageJ macro and instructions. While at Thomas Jefferson University, this work was supported by the Pennsylvania Department of Health CURE Grant TJU No. 080-37038-AI0801. Subsequently, this study was supported by a grant to AB from the National Institutes of Health (R21CA190028), and by grants to TAZ from the National Institutes of Health (R01CA122596, R01CA194593), the IU Simon Cancer Center, the Lustgarten Foundation, the Lilly Foundation, Inc., and the IUPUI Pancreas Signature Center.
Materials
| Cell culture Flasks | Falcon – Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| Image J | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
- Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
- Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
- Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
- Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
- Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
- Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
- Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
- Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
- Benny Klimek, ., E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
- Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
- Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
- Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
- Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
- Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
- Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
- Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Cancer Research. 71, 1710-1720 (2011).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
- Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
- Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
- Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
- Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
- Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
- Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
- Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
- Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
- al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
- Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
- Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
- Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
