O Colon-26 Carcinoma Tumor-rolamento Mouse como um modelo para o estudo do câncer caquexia

Summary

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

Abstract

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality¹. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma^2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength^3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)³, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism². Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Introduction

perda de massa muscular é uma complicação séria de várias condições clínicas, tais como o cancro, sépsis, fígado, cirrose, insuficiência cardíaca e renal, doença pulmonar obstrutiva crónica, e AIDS. Em particular, a perda de massa muscular é evidente em, pelo menos, 50% dos pacientes com cancro ^1. A perda de músculo esquelético nos resultados de cancro de aumento da degradação de proteínas, devido à sobre-activação dos sistemas proteolíticos do esqueleto muscular e / ou a diminuição da síntese de proteína ^6. A lipólise também é evidente, conduzindo ao esgotamento de tecido adiposo. Clinicamente, caquexia está associada com a redução da qualidade e duração de vida e é estimada como sendo a causa de morte em 20 – 30% dos doentes com cancro ^7. A utilização de modelos experimentais que se assemelham a doença humana, tanto quanto possível, seria benéfico. Um modelo animal óptima é caracterizada por uma elevada reprodutibilidade, assim como por interferência limitado de diferentes terapias e os factores imprevisíveis dedieta, sexo e antecedentes genéticos que são normalmente associados com a condição clínica ^8. Até agora, caquexia do cancro tem sido estudada principalmente em modelos animais caracterizados por transplante de células cancerosas ou de injecção de substâncias cancerígenas, embora um novo método é a utilização de ratinhos geneticamente modificados susceptíveis para o desenvolvimento de cancro.

Os ratinhos portadores de carcinoma do C26 (também referido como cancro do cólon e adenocarcinoma-26) representam um modelo bem caracterizado e amplamente utilizado de caquexia do cancro ^2,5. O crescimento dos resultados de tumores C26 no corpo e perda de peso muscular, principalmente através de gordura melhorada e catabolismo protéico ^9. Geralmente, um peso do tumor de 10% em relação ao peso total do corpo está associada com uma redução de 20-25% em peso do músculo esquelético e uma maior depleção de gordura ^3,10. Hepatomegalia e esplenomegalia também são observados com o crescimento tumoral, juntamente com a activação da resposta de fase aguda e a elevação da pró-Inflaos níveis de citocinas mmatory ^3,11. Entre estes, é bem sabido que a IL-6 desempenha um papel fundamental na mediação da perda de massa muscular no modelo de C26, embora esta citocina não é provavelmente o único indutor de caquexia ^12. Elevados de IL-6 provoca atrofia do músculo através da activação da via de JAK / STAT3, e inibindo deste factor de transcrição pode prevenir perda muscular ^3,4.

Durante a perda muscular induzida por C26, como em muitas condições de atrofia muscular, perda de massa muscular em grande parte, através de reduções do teor de proteína muscular através fibras musculares, não por meio de morte celular ou perda de fibras ^13. Em C26 caquexia, uma mudança para menores áreas transversais é observada em ambos os glicolíticas e oxidativos fibras ^2. Isso também é consistente com a redução da força muscular ^5. Muitos grupos em todo o mundo têm aproveitado o modelo C26, a fim de descobrir novos mediadores da perda de massa muscular ou drogas clinicamente relevantes para CAC câncerHexia. No entanto, muitos procedimentos diferentes para o uso deste modelo têm sido relatados, levantando preocupações sobre a consistência dos dados obtidos e posando barreiras à reprodutibilidade em diferentes condições experimentais. Aqui nós relatamos um uso típico deste modelo para o estudo da caquexia associada ao câncer que produz dados padronizados e reprodutíveis.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os estudos descritos foram aprovados pelos Comitês de Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Thomas Jefferson e Faculdade de Medicina da Universidade de Indiana. 1. C26 crescimento celular e Preparação Obter C26 células de cancro colorectal (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) e preparar o meio de crescimento completo (Modificado de Eagle Médium da Dulbecco ou seja, alta glucose (DMEM) contendo 10% de Soro Fetal Bov…

Representative Results

C26 cinética de crescimento do tumor mostrar uma fase de latência para o primeiro 7-8 d após a injecção, seguido de crescimento celular exponencial (4-5 d). A massa tumoral atinge finalmente ~ 10% do peso corporal (cerca de 2 g; Figura 1A-B). Durante a primeira fase, o tumor pode ser localizado por palpação única e aparece como uma pequena protuberância da pele. Na segunda fase, o tumor é observado como uma massa sob a pele. Raramente, o tumor …

Discussion

Especialmente em suas últimas fases, cancro colo-rectal está associada com o desenvolvimento de caquexia, que é responsável por resultados mais pobres e reduções na qualidade de vida do paciente. Muitos estudos têm focado no tratamento de condições secundárias de cancro; No entanto, apesar de muitos esforços nesse sentido, ainda não existe uma terapia aprovada para caquexia associada ao câncer ^21. Assim, é imperativo que os modelos animais assemelham-se a patologia humana, tanto quanto possível…

Materials

Cell culture Flasks	Falcon – Becton Dickinson	35-5001
DMEM	Cellgro	10-017-CV
FBS	Gibco	26140
Streptomycin-Penicillin	Cellgro	30-002-CI
CD2F1 mice	Harlan	060
Anesthesia apparatus	EZ-Anesthesia	EZ-7000
2-Methyl Butane	Sigma-Aldrich	M32631
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Cork disks	Electron Microscopy Sciences	63305
Superfrost plus glass slides	VWR	48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody	Vector Laboratories	VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21211
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110332
Xylene	Acros Organics	422680025
Cytoseal-XYL	Thermo	8312-4
Microscope	Zeiss	Observer.Z1
Bamboo Tablet	Wacom	CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011	Microsoft Corp.
Image J	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer	BD	365873