Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni
Summary
Abbiamo progettato una apparecchiatura per le colture in continuo per l'uso con i sistemi optogenetic per illuminare le culture di microbi e regolarmente celle di immagine negli effluenti con un microscopio invertito. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche a illuminazione possono essere misurati per diversi giorni.
Abstract
sistemi optogenetic utilizzano proteine geneticamente codificate che cambiano conformazione in risposta a specifiche lunghezze d'onda della luce per alterare i processi cellulari. Vi è la necessità per la coltura e misurare sistemi che incorporano programmati illuminazione e la stimolazione dei sistemi optogenetic. Vi presentiamo un protocollo per la costruzione e l'utilizzo di una apparecchiatura per le colture continua ad illuminare le cellule microbiche con dosi programmate di luce, e automaticamente acquisire e analizzare le immagini delle cellule nell'effluente. Il funzionamento di questo apparato come chemostat permette il tasso di crescita e l'ambiente cellulare per essere strettamente controllate. L'effluente della coltura cellulare continua è regolarmente campionata e le cellule vengono esposte mediante microscopia multicanale. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo che le risposte dinamiche l'intensità di fluorescenza e la morfologia cellulare delle cellule campionate dal dell'effluente cultura sono misurati su più giornisenza l'input dell'utente. Abbiamo dimostrato l'utilità di questa apparecchiatura per le colture inducendo dinamicamente produzione di proteine in un ceppo di Saccharomyces cerevisiae progettato con un sistema optogenetic che attiva la trascrizione.
Introduction
Sistemi optogenetic utilizzano la luce per controllare un numero crescente di processi cellulari tra espressione genica, 1, 2, 3, 4, 5 localizzazione proteine, l'attività della proteina 6, 6, 7, 8 vincolante proteine, 8, 9, 10 e degradazione delle proteine. 11 Un metodo per coltura di cellule in un ambiente controllato con la stimolazione ottica programmata e per misurare la loro risposta su scale temporali biologicamente rilevanti è necessaria per sfruttare le potenzialità di questi strumenti per la ricerca in biologia cellulare e delle biotecnologie. Il nostro metodo si avvale di chemostasis a mantenere un tasso di crescita costante di cella in un ben miscelato, aevalutazione, e termostatato recipiente di vetro coltura 12, 13 che è esposto all'illuminazione programmato. Noi immagini singole celle nell'effluente coltura con un microscopio invertito per misurare la risposta della cultura all'illuminazione programmato. La coltura, il campionamento, l'imaging, e l'analisi delle immagini sono completamente automatizzati in modo tale che l'intensità di fluorescenza e la morfologia cellulare della coltura cellulare effluente può essere misurata su più giorni senza l'input dell'utente.
Questo protocollo può essere implementato in molti laboratori familiarità con crescente coltura cellulare e microscopia, e l'apparecchiatura utilizzata è poco costoso e fatto di componenti prontamente disponibili. Un recipiente di coltura trasparente è posizionato sopra una matrice di diodi emettitori di luce (LED) in grado di emettere 1 W / cm 2 -10 mW / cm 2 di luce. I microbi sono coltivate nel recipiente di coltura in continuo; una pompa peristaltica viene utilizzata per aggiungere media alladiluizione, un'altra viene utilizzata per prelevare cultura ad un tasso minore al microscopio, e la differenza sfugge attraverso un'uscita di overflow. Una piastra elettrica mantiene la temperatura. L'aria viene continuamente pompata nel recipiente di coltura per mantenere una pressione positiva nonché per mescolare ed aerare la cultura. Fatta eccezione per la pompa di aria, il potere di questi dispositivi è regolato da un microcontrollore che riceve anche input da un termometro e un computer desktop collegato. La coltura cellulare effluente viene pompata ad un dispositivo microfluidico sulla scena di un microscopio invertito. Non fluorescente e le immagini fluorescenti vengono acquisite automaticamente. Le cellule nelle immagini sono caratterizzati da un algoritmo che individua ciascuna cella come una regione di interesse (ROI) e misura le proprietà di ogni ROI.
Per dimostrare l'applicazione di questo protocollo, abbiamo misurato la risposta alla luce diverse intensità di cellule di Saccharomyces cerevisiae ingegnerizzate con un respon luce bluve sistema optogenetic che controlla la trascrizione della proteina fluorescente. S. cerevisiae, comunemente noto come lievito di birra, è stato scelto perché più sistemi optogenetic per controllare l'espressione genica in questo sistema esistono già 14, 15, 16. Inoltre, questo organismo modello è comunemente utilizzato per studi in biologia dei sistemi 17 e come telaio per applicazioni biotecnologiche 18, 19, 20. I nostri risultati rappresentativi dimostrano che questo protocollo può essere utilizzato per controllare la trascrizione di una cultura su più giorni variando intensità di luce di ingresso e misurando la produzione di un reporter fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo progettato questo apparecchio ogni esigenza. Tutto il codice utilizzato è gratuito e open-source. Il processo di analisi delle immagini di default per le cellule del segmento è semplice e viene eseguito rapidamente. Analisi personalizzata può essere attuata facendo registrare input dell'utente mentre analizzando un'immagine rappresentativa con l'interfaccia grafica utente FIJI, convertendo l'ingresso a uno script BeanShell, e quindi impostando il plugin per chiamare lo script. Quando viene chi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo riconoscere Molly Lazar e Veronica Delgado per l'assistenza in fase di test del protocollo, Kieran Sweeney per utili discussioni e l'editing, e Taylor Scott, My An-adirekkun, e Stephanie Geller per la lettura critica del manoscritto. Megan Nicole McClean, Ph.D. detiene un premio alla carriera al interfaccia Scientifico del Fondo di Burroughs Wellcome.
Materials
| Extensive lab manual | GitHub | NA | An extensive, regularly updated lab manual is available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). This also includes a description of the microfluidic mold used to generate the representative results. |
| Fritzing Design Viewer | Fritzing | NA | The free, open-sourced software to view and edit the .fzz type circuit board designs is available at "http://fritzing.org/download/" |
| Arduino Uno R3 (Atmega328 – assembled) | Adafruit | 50 | Microcontroller. 1 required. |
| Arduino Stackable Header Kit | SparkFun Electronics | 10007 | Female pin headers for connecting PCB to microcontroller. 1 required. |
| Adjustable 30W 110V soldering iron – XY-258 110V | Adafruit | 180 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Soldering iron stand | Adafruit | 150 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| Mini Solder spool – 60/40 lead rosin-core solder 0.031" diameter – 100g | Adafruit | 145 | For making electrical connections to the PCB. 1 required. |
| 0.1 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-08375 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| 10 μF capacitor | SparkFun Electronics | COM-00523 | Stabilizes voltage in PCB. 1 required. |
| MAX7219CNG LED Matrix/Digit Display Driver – MAX7219 | Maxim | MAX7219CNG | LED driver. 1 required. |
| 8 pin IC Socket | Mouser Electronics | 575-144308 | 16 required. These will be stacked on top of each other to support the culture vessel above the LED matrix. |
| 24 Pin IC socket | Mouser Electronics | 535-24-3518-10 | Optional. Use this to reversibly attach the MAXIM 7219CNG driver to the PCB. |
| Digital multimeter | Adafruit | 2034 | For troubleshooting electronics. 1 required. |
| Break Away Headers – 40-pin Male (Long Centered, PTH, 0.1") | SparkFun Electronics | PRT-12693 | Male pin headers for connected LED matrix to printed circuit board. Ends can be trimmed with wire cutters. 1 set required. |
| Flush diagonal wire cutters | Adafruit | 152 | For trimming long pin headers and cutting power cables. 1 required. |
| Premium Female/Female Jumper Wires – 40 x 12" (300mm) | Adafruit | 793 | Wire ribbon for connecting breadboard to LED matrix. Can be connected end-to-end with male pin-headers to be longer. 1 required. |
| Half-size breadboard | Adafruit | 64 | The LED matrix will connect to this and the culturing vessel will rest above it. |
| Miniature 8×8 Blue LED Matrix | Adafruit | 956 | Light source. Dominant wavelength is 470nm (blue). 1 required. Alternative miniature LED matrices from the same vendor are available with dominant wavelengths: 624 nm (red), 588 nm (yellow), 525 nm (green), 572 nm (yellow-green), and white. |
| Stackable header-3 pin | SparkFun Electronics | 13875 | 8 required. |
| Resistor Kit – 1/4W (500 total) | SparkFun Electronics | 10969 | For electronics. 1 required. |
| IRL520N MOSFET | International Rectifier | IRL520N | Voltage regulating switch for controlling DC current. 4 required. |
| Hook-Up Wire – Assortment (Solid Core, 22 AWG) | SparkFun Electronics | PRT 11367 | Wire for electronics. 1 required. |
| 5V 2A (2000mA) switching power supply – UL Listed | Adafruit | 276 | Power supply for the heating pad and Arduino. 2 required. |
| 12 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 798 | For peristaltic pumps. 2 required. |
| Electric Heating Pad – 10cm x 5cm | Adafruit | 1481 | For heating the bioreactor. 1 required. |
| Low flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-1 | For pumping media. 1 required |
| Medium flow variable flow peristaltic pump | Fisher Scientific | 13-876-2 | For pumping culture. 1 required. |
| 9 VDC 1000mA regulated switching power adapter – UL listed | Adafruit | 63 | For microcontroller power supply. Order 1. |
| High Temp Waterproof DS18B20 Digital temperature sensor + extras | Adafruit | 642 | Thermometer for the bioreactor. 1 required. |
| Micromanager | Micromanager | NA | The free, open-sourced microscope control software is available at "https://micro-manager.org/wiki/Download_Micro-Manager_Latest_Release" |
| FIJI | ImageJ | NA | The free, open-sourced image analysis software is available at "http://fiji.sc/" |
| Arduino Integrated Development Environment | Arduino | NA | The free, open-sourced IDE is available at "https://www.arduino.cc/en/Main/Software" |
| Custom code | GitHub | NA | The custom microcontroller code and "Bioreactor Controller" plugin are available in the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| USB Cable A to B – 6 Foot | SparkFun Electronics | CAB-00512 | Used to download data to microcontroller. 1 required. |
| bioreactorTimecourse_example.csv | GitHub | NA | The advantage of loading LED matrix values from a CSV file is that a program can be called by the plugin to update those values based on image analysis results, and those values can be reloaded to the microcontroller, enabling feed-back control. It is available from the “Optogenetic Chemostat Files” GitHub repository (https://github.com/McCleanResearch/Optogenetic-Chemostat-Files). |
| Tota-frost gels (diffusion paper) | B&H | B&H # LOFSFTL MFR # T1-72 |
For LED matrix. 1 required. |
| Kitting Sheet Crosslink 1/4x12x24in | Grainger, inc | 20JL37 | Black foam for culturing vessel enclosure. 4 required. |
| Standard Photodiode Power Sensor, Si, 200 – 1100 nm, 50 mW | Thorlabs | S120VC | For measuring light intensity. 1 required. |
| Labelling Tape | Fisher Scientific | 159015N | For labelling and securing loose components. 1 required. |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | For measuring light intensity. 1 required. |
| 100mL GL45 hybridization glass bottle | Bellco Glass, Inc. | (7910-40150) | Bioreactor vessel. 1 required. |
| Six port assembly | Bellco Glass, Inc. | Custom | For the bioreactor vessel. Tubing Specs: .125" OD x .055"ID. Port A: 1.0" long above cap slug and to bottom of tube. Ports B,C,E,F: 1.0" long above cap slug, 33 mm long below. Port D: 1.0" long above cap slug, 65 mm long below. 1 required. Includes 45 mm diameter polypropylene open top screw cap and a white silicone gasket to ensure a tight seal between the cap and the vessel. |
| Scotch Magic Tape 3105, 3/4 x 300 Inches, Pack of 3 | Amazon | B0009F3P3U | Clear scotch tape. This is available from many other vendors. It is used to cover markings on the culturing vessel and to secure the coverglass with the PDMS channel to the aluminum support frame. |
| 1/16" ID x 3/16" OD x 1/16" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57288 | Tubing. ~25' required. |
| Cole-Parmer Twistit white rubber stopper, size 10 | Cole-Parmer | EW-62992-32 | Media flask stopper and effluent flask stopper. 2 required. |
| 2L Laboratory Flask | Pyrex | 4980 | Media flask and effluent flask. 2 required. |
| Day pinchcock | Fisher Scientific | 5867 | For pinching tubes shut. 3 required. |
| Replacement tubing assembly 1/16" ID | Traceable Products | 3372 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Replacement tubing assembly 1/50" ID | Traceable Products | 3371 | The peristaltic pumps come with a set of tubes, but they wear out after weeks of use. |
| Male luer with lock ring x 1/16" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-00 | Connectors. ~10 luers are required. |
| Male luer with lock ring x 1/8" hose barb, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45505-04 | Connectors. 5 required, one for each rubber stopper hole to fill with tubing. |
| Female luer x 1/16" hose barb adapter, Nylon, 25/pk | Cole-Parmer | EW-45502-00 | Connectors. ~10 luers required. |
| Female luer x 3/16" hose barb adapter | Cole-Parmer | EW-45502-08 | Connectors. ~10 luers required. |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Female Luer Cap, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | SC-45502-28 | |
| Cole-Parmer Luer Accessory, Male Luer Lock Plug, Nylon, 25/Pk | Cole-Parmer | EW-45505-56 | |
| Microbore PTFE Tubing, 0.022"ID x 0.042"OD, 100 ft/roll | Cole-Parmer | EW-06417-21 | Tubing. 1 roll required. |
| Masterflex platinum-cured silicone tubing, L/S 13, 25 ft | Cole-Parmer | EW-96410-13 | Tubing. ~25' required. |
| 3/16" ID x 1/4" OD x 1/32" Wall Tygon Sanitary Silicone Tubing | United States Plastic Corp. | 57293 | Tubing. ~1' required. |
| Vacuum filter | Fisher Scientific | 974107 | Nalgene vacuum filter for sterile filtering media. |
| Aquel Oxy-Boost 200 | Rena Aquatic Supply | AP200 | Dual diaphram adjustable flow air pump for aerating and mixing media. 1 required. |
| 0.2 μm pore syringe filter | Corning International | 431229 | This ensures that air from the aquarium pump does not contaminate the apparatus. 1 required. |
| Slygard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Slygard 184 | For microfluidic device. 1 required. |
| American Safety Razor GEM Scientific Single-Edge Razor Blades | Fisher Scientific | 17989000 | For cutting tubes and PDMS. 1 blade required. |
| Harris Uni-Core hole puncher 1.2mm ID | Sigma-Aldrich | WHAWB100028 ALDRICH | For punching inlet/outlet in microfluidic device. 1 required. |
| Microscope cover glass 22×60-1.5 | Fisher Scientific | 12-544-G | For microfluidic device. 1 required. |
| Rectangular aluminum frame with a square window | Custom | Custom | To support the microfluidic channel. Outer dimensions: 3 inches x 1.25 inches. Inner dimmensions (cut out portion): 7/8 inches x 7/8 inches Thickness: ~1/32 inches |
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