A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
सेना के प्रति संवेदनशील, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट सेंसर हाल ही में, जीवित कोशिकाओं में तन्य आधारित बलों को मापने कैसे यांत्रिक बलों प्रोटीन 1, 2, 3, 4 में लागू कर रहे हैं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरा है। इन उपकरणों के साथ, शोधकर्ताओं ने पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में गैर invasively छवि intracellular बलों कर सकते हैं। ये सेंसर एक झल्लाहट जोड़ी (दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सबसे अधिक बार एक नीले और पीले रंग दाता स्वीकर्ता) एक लोचदार पेप्टाइड 3 के द्वारा अलग से मिलकर बनता है। इसके विपरीत सी या एन टर्मिनल टैगिंग करने के लिए, यह सेंसर एक प्रोटीन यांत्रिक बल प्रोटीन पर आसानी से ट्रांसमिट को मापने के लिए एक आंतरिक साइट में डाला जाता है, एक आणविक तनाव गेज के रूप में व्यवहार। झल्लाहट पी के बीच एक वृद्धि की दूरी में सेंसर परिणाम भर में यांत्रिक तनाव में वृद्धिहवा, कम झल्लाहट 3 में जिसके परिणामस्वरूप। नतीजतन, झल्लाहट विपरीत रूप से तन्य शक्ति से संबंधित है।
ये फ्लोरोसेंट आधारित सेंसर फोकल आसंजन प्रोटीन (vinculin 3 और Talin 4), cytoskeletal प्रोटीन (α-actinin 5), और सेल सेल जंक्शन प्रोटीन के लिए विकसित किया गया है (ई-Cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, और PECAM 8)। सबसे अधिक इस्तेमाल और अच्छी तरह से विशेषता इन biosensors में लोचदार लिंकर TSmod रूप में जाना जाता है और 40 अमीनो एसिड, (GPGGA) 8, जो मकड़ी रेशम प्रोटीन flagelliform से निकाला गया था की एक दोहराव अनुक्रम के होते है। TSmod एक रेखीय लोचदार नैनो वसंत के रूप में तन्य शक्ति 3 से 5 पी.एन. के लिए 1 के लिए झल्लाहट जवाबदेही के साथ, व्यवहार करने के लिए दिखाया गया है। flagelliform के विभिन्न लंबाई गतिशील आर को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताTSmod झल्लाहट बल संवेदनशीलता 9 की Ange। इसके अलावा flagelliform करने के लिए, spectrin दोहराता 5 और villin टोप पेप्टाइड (HP35 के रूप में जाना जाता है) 4 समान बल biosensors 4 में झल्लाहट जोड़े के बीच लोचदार पेप्टाइड्स के रूप में इस्तेमाल किया गया है। अंत में, एक ताजा रिपोर्ट से पता चला कि TSmod भी संपीड़न बलों 10 पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।
हमने हाल ही में TSmod एक पहले से विकसित छोटा कर दिया Nesprin2G प्रोटीन के रूप में मिनी Nesprin2G (चित्रा 2C) है, जो अंतर्जात की तरह ही बर्ताव में जाना जाता है में डाला का उपयोग करके nucleo-cytoskeleton (LINC) जटिल प्रोटीन Nesprin2G के संयोजक के लिए एक बल सेंसर विकसित Nesprin-2 जी 11। LINC जटिल है कि बाहर से नाभिक के अंदर करने के लिए नेतृत्व, परमाणु पटल को cytoplasmic cytoskeleton जोड़ने कई प्रोटीन होता है। Nesprin-2 जी एक संरचनात्मक प्रोटीन के लिए बाध्य किया जाता है दोनोंकोशिका द्रव्य में और perinuclear अंतरिक्ष में रवि प्रोटीन actin cytoskeleton। हमारे बायोसेंसर का उपयोग करना, हम दिखाने के लिए कि Nesprin-2 जी NIH3T3 fibroblasts 2 में actomyosin पर निर्भर तनाव के अधीन है में सक्षम थे। यह पहली बार है कि बल सीधे परमाणु LINC परिसर में एक प्रोटीन भर में मापा गया था था, और यह mechanobiology में नाभिक पर बल की भूमिका को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनने की संभावना है।
नीचे प्रोटोकॉल कैसे Nesprin-2 जी बल सेंसर का उपयोग करने Nesprin तनाव सेंसर (Nesprin-टीएस) स्तनधारी कोशिकाओं में की अभिव्यक्ति है, साथ ही अधिग्रहण और Nesprin- व्यक्त कोशिकाओं की झल्लाहट छवियों का विश्लेषण सहित, की एक विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है टीएस। एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर से लैस एक औंधा कोंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, कैसे अवगत उत्सर्जन को मापने के लिए के विवरण के वर्णक्रमीय unmixing का उपयोग कर चिंता और ratiometric झल्लाहट इमेजिंग प्रदान की जाती है। उत्पादन ratiometric छवियों रिश्तेदार योग्यता के रूप में बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताntitative बल तुलना। इस प्रोटोकॉल fibroblasts में Nesprin-टीएस की अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित है, लेकिन यह आसानी से दोनों सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं सहित अन्य स्तनधारी कोशिकाओं, के लिए अनुकूल है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के रूप में यह छवि अधिग्रहण और झल्लाहट विश्लेषण से संबंधित है आसानी से अन्य झल्लाहट आधारित बल biosensors कि अन्य प्रोटीन के लिए विकसित किया गया है करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता।
एक विधि और Nesprin-2 जी, परमाणु LINC परिसर में एक प्रोटीन भर में यांत्रिक तनाव का लाइव सेल इमेजिंग के प्रदर्शन, ऊपर उल्लिखित किया गया था। यह काम करने से पहले, इस तरह के micropipette आकांक्षा, चुंबकीय-मनका cytometry, और सूक्ष्म ल?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम के थॉमस एफ और केट मिलेर जेफ्फ्रेस मेमोरी ट्रस्ट (डीईसी) और एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया R35GM119617 (डीईसी के लिए) प्रदान करते हैं। कोंफोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग VCU नेनोसामग्री विशेषता कोर (एनसीसी) सुविधा पर प्रदर्शन किया था।
Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
Ampicillin | Sigma | A9518 | |
Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |