Summary

Eficiente e Rotulagem de anticorpos por cicloadição Azide-alcino promoveu-Strain Site-specific

Published: December 23, 2016
doi:

Summary

Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).

Abstract

Atualmente muitas ferramentas químicas disponíveis para introduzir sondas químicas em proteínas para estudar sua estrutura e função. Um método útil é a conjugação de proteínas geneticamente pela introdução de um aminoácido não natural contendo um grupo funcional bioorthogonal. Este relatório descreve um protocolo detalhado para site-specific a conjugação de anticorpos. O protocolo inclui detalhes experimentais para a incorporação genética de um aminoácido contendo azida, e a reacção de conjugação por cicloadição azida-alcino promoveu-deformação (SPAAC). Esta reacção promovida por deformação prossegue por mistura simples das moléculas de reacção a pH e temperatura fisiológicos, e não requer reagentes adicionais, tais como cobre (I) e os iões ligandos quelantes de cobre. Por conseguinte, este método seria útil para a conjugação de proteínas em geral e ao desenvolvimento de conjugados de anticorpo e fármaco (ADCs).

Introduction

Uma vez que a incorporação genética de p -methoxyphenylalanine em Escherichia coli foi relatado, 1 mais de 100 aminoácidos não naturais (UAAS) foram incorporados com sucesso em várias proteínas. 1-3 Entre estes UAAS, os aminoácidos contêm grupos funcionais bioorthogonal têm sido extensivamente estudados e representam a maior proporção. Os grupos funcionais bioorthogonal utilizados nos UAAS incluem cetona, 4 azida, alcino 5, 6 cyclooctyne, tetrazina 7, 8 α, amida β-insaturado, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Embora cada grupo funcional tem as suas vantagens e desvantagens, os aminoácidos contendo azida foram mais extensivamente utilizada para a conjugação de proteínas. p -Azidophenylalanine (AF), um dos aminoácidos contendo azido, está prontamente disponível, e a sua incorporação efficiency é excelente. pode-se fazer reagir as proteínas mutantes contendo este aminoácido com alcinos por cicloadição catalisada por cobre ou com cyclooctynes ​​por SPAAC. 12-20

Recentemente, biofármacos têm atraído muita atenção na indústria farmacêutica. O conjugado anticorpo-fármaco (ADC) é uma classe de anticorpos terapêuticos que são vantajosos devido à sua capacidade para terapia-alvo para o tratamento de cancros humanos e 21 outras doenças. Mais de 50 ADCs estão actualmente em ensaios clínicos, eo número está aumentando rapidamente. No desenvolvimento dos ADCs, muitos factores devem ser considerados para maximizar a eficácia e minimizar os efeitos colaterais. Entre estes factores, a reacção de conjugação eficiente e específica do local para formar uma ligação covalente entre um anticorpo e um fármaco é crítica. A eficiência e especificidade desejada na reacção de conjugação pode ser conseguida por conjugação com um grupo funcional numa bioorthogonalaminoácido não natural que é especificamente incorporada num anticorpo. 22-26 Aqui, nós relatamos um protocolo para o site especificamente incorporar AF em um fragmento de anticorpo e o conjugado do fragmento de anticorpo mutante com uma sonda bioquímica.

Protocol

1. O plasmídeo Construção Construir um plasmídeo de expressão (pBAD-HerFab-L177TAG) que expressam o gene do anticorpo alvo (pBAD-HerFab-WT) com um Sua 6-tag, e substituir o codão para a leucina-177 com o códon de âmbar (TAG) 27, utilizando técnica de mutagénese dirigida ao local convencional. Veja a Tabela de Materiais. Construir outro plasmídeo de expressão (pEVOL-AFRS) contendo os genes para o tRNA Tyr evoluiu e aminoacil-tRNA si…

Representative Results

Neste estudo, um fragmento de anticorpo foi local especificamente conjugado com um fluoróforo por incorporação de um aminoácido contendo azida no fragmento e fazendo reagir o fragmento de anticorpo mutante com um cyclooctyne tensas (Figura 1). HerFab foi seleccionado como o fragmento de anticorpo-alvo em que AF foi incorporado como um aminoácido contendo azida. Para escolher o resíduo em HerFab para a substituição com FA, foi analisada a estrutura de crista…

Discussion

A incorporação genética de aminoácidos não naturais em proteínas tem várias vantagens sobre outros métodos utilizados para a modificação de proteínas. 3/1 Uma das vantagens importantes é a sua aplicabilidade em geral a qualquer tipo de proteína. Em princípio, não há limitação na escolha de uma proteína alvo e um local alvo da proteína. No entanto, a substituição de um resíduo estruturalmente ou funcionalmente importante com um UAA pode resultar na alteração da estrutura e função da …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

1. plasmid Construction
plasmid pBAD_HerFab_L177TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
plasmid pEvol-AFRS Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010)
DH10B Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1g
LB Broth BD Difco 244620 500g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25g
Agar SAMCHUN 214230 500g
SOC medium Sigma S1797 100ML
3. Expression and purification of HerFab-L177AF
3.1 Expression of Herfab-L177AF
p-azido-L-phenylalanine (AF) Bachem F-3075.0001 1g
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500ml
3.2 Cell lysis
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500g
EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% SAMCHUN E0064 1kg
Sucrose Sigma S9378 500g
Lysozyme Siyaku 126-0671 1g
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25ml
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1ml capacity
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1kg
4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
5. Purification of Labeled HerFab
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10ml
MES running buffer Thermofisher NP0002 500ml
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25g
Typhoon 9210 variable mode imager Amersham Biosciences

References

  1. Wang, L., Schultz, P. G. Expanding the genetic code. Angew. Chem. Int. Ed. 44 (1), 34-66 (2004).
  2. Wu, X., Schultz, P. G. Synthesis at the interface of chemistry and biology. J. Am. Chem. Soc. 131 (35), 12497-12515 (2009).
  3. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  4. Wang, L., Zhang, Z., Brock, A., Schultz, P. G. Addition of the keto functional groupto the genetic code of Escherichia coli. proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (1), 56-61 (2003).
  5. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. J. Am. Chem. Soc. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  6. Deiters, A., Schultz, P. G. In vivo incorporation of an alkyne into proteins in Esshcerichia coli. Bioorg. Med. Chem. Lett. 15 (5), 1521-1524 (2005).
  7. Plass, T., Milles, S., Koehler, C., Schultz, C., Lemke, E. A. Genetically encoded copper-free click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (17), 3878-3881 (2011).
  8. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with transcyclooctenes. J. Am. Chem. Soc. 134 (6), 2898-2901 (2014).
  9. Lee, Y. -. J., et al. A genetically encoded acrylamide fuctionality. ACS Chem. Biol. 8 (8), 1664-1670 (2013).
  10. Lang, K., et al. Genetically encoded norbornene directs site-specific cellular protein labelling via a rapid bioorthogonal raction. Nat Chem. 4 (4), 298-304 (2012).
  11. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. J. Am. Chem. Soc. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  12. Jewett, J. C., Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Rapid Cu-free click chemistry with readily synthesized biarylazacyclooctynones. J. Am. Chem. Soc. 132 (11), 3688-3690 (2010).
  13. Debets, M. F., et al. Azadibenzocyclooctynes for fast and efficient enzyme PEGylation via copper-free (3 + 2) cycloaddition. Chem. Commun. 46 (1), 97-99 (2010).
  14. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From mechanism to mouse: a tale of two bioorthogonal reactions. Acc. Chem. Res. 44 (9), 666-676 (2011).
  15. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with strained alkenes and alkynes. Acc. Chem. Res. 44 (9), 805-815 (2011).
  16. Mbua, N. E., Guo, J., Wolfert, M. A., Steet, R., Boons, G. -. J. Strain-promoted alkyne−azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 1912-1921 (2011).
  17. Kuzmin, A., Poloukhtine, A., Wolfert, M. A., Popik, V. V. Surface functionalization using catalyst-free azide-alkyne cycloaddition. Bioconjug. Chem. 21 (11), 2076-2085 (2011).
  18. Yao, J. Z., et al. Fluorophore targeting to cellular proteins via enzymemediated azide ligation and strain-promoted cycloaddition. J. Am. Chem. Soc. 134 (8), 3720-3728 (2012).
  19. Hao, Z., Hong, S., Chen, X., Chen, P. R. Introducing bioorthogonal functionalities into proteins in living cells. Acc. Chem. Res. 44 (9), 742-751 (2011).
  20. Reddington, S. C., Tippmann, E. M., Jones, D. D. Residue choice defines efficiency and influence of bioorthogonal protein modification via genetically encoded strain promoted Click chemistry. Chem. Commun. 48 (9), 8419-8421 (2012).
  21. Chari, R. V. J., Miller, M. L., Widdison, W. C. Antibody-drug conjugates: an emerging concept in cancer therapy. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (15), 3751-4005 (2014).
  22. Tsao, M., Tian, F., Schultz, P. G. Selective staudinger modification of proteins containing p-Azidophenylalanine. ChemBioChem. 6 (12), 2147-2149 (2005).
  23. Brustad, E. M., Lemke, E. A., Schultz, P. G., Deniz, A. A. A general and efficient method for the site-specific dual-labeling of proteins for single molecule fluorescence resonance energy transfer. J. Am. Chem. Soc. 130 (52), 17664-17665 (2008).
  24. Milles, S., et al. Click strategies for single-molecule protein fluorescence. J. Am. Chem. Soc. 134 (11), 5187-5195 (2012).
  25. Jang, S., Sachin, K., Lee, h. J., Kim, D. W., Lee, h. S. Development of a simple method for protein conjugation by copper-free click reaction and its application to antibody-free Western blot analysis. Bioconjug. Chem. 23 (11), 2256-2261 (2012).
  26. Kazane, S. A., et al. Self-assembled antibody multimers through peptide nucleic acid conjugation. J. Am. Chem. Soc. 135 (1), 340-346 (2012).
  27. Ko, W., et al. Efficient and site-specific antibody labeling by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bull. Korean Chem. Soc. 36 (9), 2352-2354 (2015).
  28. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374 (2010).
  29. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  30. Cho, H. S., et al. Structure of the extracellular region of HER2 alone and in complex with the Herceptin Fab. Nature. 421 (6924), 756-760 (2003).
  31. Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. Click chemistry : Diverse chemical function from a few good reactions. Angew. Chem. Int. Ed. 40 (11), 2004-2021 (2001).

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Kim, S., Ko, W., Park, H., Lee, H. S. Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition. J. Vis. Exp. (118), e54922, doi:10.3791/54922 (2016).

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