Summary

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Published: February 24, 2017
doi:

Summary

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Abstract

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduction

Defecten in gewrichtskraakbeen niet genezen natuurlijk. Bijgevolg stamcel is voorgesteld als een veelbelovende benadering voor het herstel van aangetast kraakbeen. Deze werkwijze vereist zowel het verkrijgen van een voldoende aantal stamcellen en de inductie van deze cellen chondrogene differentiatie ondergaan. Beenmerg (BM) is op grote schaal gebruikt als bron van stamcellen, maar celisolatie van BM heeft twee belangrijke nadelen: invasiviteit en onvoldoende opbrengst. Vanwege het gemak van verwerving, vetweefsel is een voorkeur bron van stamcellen. Eerdere studies toonden de haalbaarheid van het isoleren van stamcellen uit vetweefsel en het induceren van chondrogene differentiatie van deze cellen met behulp cytokines zoals TGF-β1 1, 2. Deze werkwijzen zijn effectief maar duur.

Als goedkopere alternatief voor cytokinen, kunnen mechanische belasting worden gebruiktchondrogene differentiatie induceren. Mechanische belasting speelt een cruciale rol bij het handhaven van de gezondheid van gewrichtskraakbeen 3, en kan chondrogene fenotypes in verschillende cellen. Bijvoorbeeld, hydrostatische druk veroorzaakt chondrogene fenotypen in synovium afgeleide progenitorcellen via de MAP kinase / JNK pathway 4 en mechanische compressie veroorzaakt chondrogenese van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) van genen opwaarts reguleren chondrocytische 5. Bovendien afschuifspanning bij tot de expressie van chondrogenese gerelateerde extracellulaire matrix (ECM) in humane MSC's 6. Centrifugale zwaartepunt (CG), een gemakkelijk worden gecontroleerd spanning gegenereerd door centrifugeren, kan differentiële genexpressie in cellen 7 induceren. Bijvoorbeeld, in longepitheelcellen carcinoomcellen, de expressie van interleukine (IL) -1 ter opgereguleerd door centrifugeren 8. Therefore, als experimenteel induceerbare spanning, CG kan worden gebruikt om chondrocyte genexpressie te induceren in stamcellen. Het blijft echter onduidelijk of CG het chondrogene differentiatie van stamcellen kunnen induceren.

In deze studie hebben we vastgesteld dat CG induceerde de opregulatie van SOX9, regulering van de chondrogenese in menselijk ASCs, wat resulteert in de overexpressie van chondrocyte genen. Verder vergeleken we de effecten van CG op chondrogenese met die van TGF-β1, de groeifactor meest gebruikte in vitro chondrogenese te induceren in stamcellen.

Protocol

Deze studie protocol werd goedgekeurd door de institutionele review board van de Katholieke Universiteit van Korea (KC16EAME0162) en uitgevoerd volgens de NIH richtlijnen. Alle weefsels werden verkregen met schriftelijke informed consent. 1. Centrifugaal Zwaartekracht laden en Pellet Cultuur Celcultuur en oogst Cultuur ASC (P2-P3, zie Lijst van Materials) in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium-laag glucose (DMEM-LG) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) …

Representative Results

Centrifugale zwaartekracht induceert de overexpressie van chondrogene differentiatie merkers in adipeus afgeleide stamcellen. Om de mate van centrifugale zwaartekracht die geschikt is voor chondrogene differentiatie te induceren, werden ASC gestimuleerd met verschillende graden van CG (0, 300, 600, 1200 en 2400 x g) gedurende 15 min. Na stimulatie, het ASC werden opnieuw gezaaid in kweekplaten en gekweekt gedurende 24 uur. Zoa…

Discussion

Stemness de toestand van cellen is zeer belangrijk voor CG-geïnduceerde overexpressie van SOX9. In onze studie konden SOX9 expressie worden geïnduceerd door CG in vroege passage ASC's (2-3), maar niet in latere doorgang ASC. Het is gerapporteerd dat, tijdens de teelt, ASC bevatten CD34 + -cellen tot 3 passages 16. ASC neiging om de expressie van CD34 verliezen de cellen gepasseerd, waardoor een lage respons CG.

Met centrifugale zwaartekracht, kan hydrostatische …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary’s Hospital, The Catholic University of Korea.

Materials

Plasticware
100mm Dish TPP 93100
60mm Dish TPP 93060
50 mL Cornical Tube SPL 50050
15 mL Cornical Tube SPL 50015
10 mL Disposable Pipette Falcon 7551
5 mL Disposable Pipette Falcon 7543
Name Company Catalog Number Comments
ASC Culture Media Materials
DPBS Life Technologies 14190-144
DMEM Low glucose Life Technologies 11885-084 growth base media
Penicilin Streptomycin Sigma Aldrich P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 10%
PBS/1 mM EDTA Life Technologies 12604-039
Name Company Catalog Number Comments
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose Life Technologies 11995 chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Life Technologies 11140-050
Dexamethasone Sigma Aldrich D2915 100nM
Penicilin Streptomycin Life Technologies P4333 1%
Fetal Bovine Serum Life Technologies 16000-044 1%
Ascorbate-2-phosphate Sigma Aldrich A8960 50ug/ml
L-proline Sigma Aldrich P5607 50ug/ml
ITS BD 354352 1%
Human TGFβ1 Peprotech 100-21 10ng/ml
Name Company Catalog Number Comments
Materials
18 mm Cover Glass Superior HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde Tech & Innovation BPP-9004
Tween 20 BIOSESANG T1027
Bovine Serum Albumin Vector Lab SP-5050
Anti-Collagen II antibody abcam  ab34712 1:100
 Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody,
 Alexa Fluor 594 conjugate 
Molecular Probe  A-11037 1:200
DAPI Molecular Probe D1306
Prolong gold antifade reagent Invitrogen P36934
Slide Glass, Coated Hyun Il Lab-Mate HMA-S9914
Trizol Invitrogen 15596-018
Chloroform Sigma Aldrich 366919
Isoprypylalcohol Millipore 109634
Ethanol Duksan 64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit Thermo Scientfic K1622
i-Taq DNA Polymerase iNtRON BIOTECH 25021
UltraPure 10X TBE Buffer Life Technologies 15581-044
loading star Dyne Bio A750
Agarose Sigma-Aldrich 9012-36-6
1kb (+) DNA ladder marker Enzynomics DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)  Catholic MASTER Cells

References

  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, 1161-1166 (2000).

Play Video

Cite This Article
Jang, Y., Jung, H., Ju, J. H. Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity. J. Vis. Exp. (120), e54934, doi:10.3791/54934 (2017).

View Video